单色红光与宽谱白光对生物光伏技术的比较效应：稳定性、效率及应用潜力

《Bioelectrochemistry》：Comparative effects of monochromatic red and broad-spectrum white light on biophotovoltaics: Stability, efficiency, and application potential

本研究评估了使用叠氮化钾作为介体的生物光电池系统在单色红光和宽谱白光下的性能。结果表明，高强度白光导致叠氮化钾分解，释放有毒氰化物，抑制细胞活性；而红光能保持介体稳定，促进电子外传，即使在高强度下（1200 μmol photons m?2 s?1）仍能高效发电。研究强调了光质与介体稳定性的匹配对户外BPV系统的重要性。

　　本研究探讨了在不同光照条件下，一种以铁氰化物为媒介的生物光伏（BPV）系统的表现。BPV系统利用蓝藻的光合作用过程，将太阳能转化为电能，这一过程通过细胞外电子传递（EET）路径实现。研究主要关注了单色620纳米红光与全光谱白光在低（50微摩尔光子/平方米/秒）和高（300微摩尔光子/平方米/秒）光照强度下的影响。铁氰化物因其在长期户外应用中的稳定性和实用性，被选为最合适的媒介。研究发现，在低光照强度下，两种光照条件下的光电流表现相似；但在高光照强度下，白光导致铁氰化物分解，产生有毒的氰化物，从而影响细胞活性和系统功能。相比之下，红光不仅维持了媒介的稳定性，还显著提高了EET效率，即使在非常高的光照强度下（最高可达1200微摩尔光子/平方米/秒）也能保持较高的光电流输出。这些结果表明，为了实现BPV系统的最佳性能，需要在微生物色素吸收和媒介稳定性之间找到合适的光照条件。此外，研究还强调了红光在提高EET效率方面的潜力，以及其在实际太阳能条件下的应用前景。

蓝藻是一类能够进行氧气光合作用的革兰氏阴性细菌，它们至少在24亿年前就已经出现。蓝藻以其卓越的适应能力而闻名，能够在多种环境中生存。它们通过主色素和辅助色素的组合进行氧气光合作用，其中主色素是普遍存在的叶绿素a（Chl a），主要吸收蓝光和红光，其吸收峰分别在440纳米和678纳米左右。辅助色素，如藻胆蛋白和类胡萝卜素，可以扩展光吸收的波长范围，使得蓝藻能够利用更广泛的光谱。藻胆蛋白是重要的辅助色素，根据其吸收峰可分为三种类型：藻蓝蛋白（约620纳米）、藻红蛋白（约650纳米）和藻黄蛋白（480-570纳米）。这些色素被组织在藻胆体中，作为光捕获天线，高效地将吸收的光能传递给光系统，从而驱动光合作用过程。值得注意的是，藻胆蛋白在蓝藻的光捕获过程中往往比叶绿素a发挥更大的作用。这种复杂的色素系统使得蓝藻能够在不同波长的光照条件下调整其光吸收和利用效率。

关于光照质量对蓝藻生长和生理的影响，已有研究表明，蓝藻在红光下的生长速率通常高于白光。例如，Luimstra等人发现，蓝藻孢子PCC 6803在蓝光下的生长速度比橙光或红光慢，他们将这种现象归因于光系统I（PSI）和光系统II（PSII）之间的能量失衡。此外，红光还被证明能够优化蓝藻的生物量形成，并提高其生长速率。相比之下，绿光在某些海洋蓝藻中被发现能促进最高的生物量生产。尽管全光谱光照理论上更优，但相关的比较研究仍然有限。例如，在淡水蓝藻Pseudanabaena mucicola中，全光谱白光相比单色蓝光能够促进生长和藻胆蛋白的生产。然而，在某些情况下，单色620纳米光在蓝藻的生长速率上优于全光谱白光或680纳米单色光。这些研究结果表明，光照质量与蓝藻生理之间的关系需要进一步研究，以优化其培养和应用。

作为一项新兴的研究领域，生物光伏（BPV）系统利用蓝藻进行光能转换，近年来受到越来越多的关注。在BPV系统中，蓝藻通过光合作用催化水的分解，生成电子和质子，这些被电极收集并转化为电能。与传统的微生物燃料电池不同，BPV系统不依赖有机底物作为电子来源，而是利用水。BPV系统的性能受到细胞外电子传递（EET）效率的显著影响，因为EET直接依赖于光合作用过程中产生的电子。因此，提高光合作用效率，这与光照质量密切相关，是提升BPV系统整体功能和效果的关键步骤。因此，研究光照质量对BPV系统的影响是优化其性能的必要前提。

BPV系统的一个独特之处在于使用了媒介，这些媒介能够促进生物电化学系统中的电子传递。与模型外源电子供体如Shewanella或Geobacter不同，蓝藻缺乏细胞膜上的多血红素细胞色素，如OmcS和MtrCAB，这些细胞色素能够直接促进电子从细胞膜传递到阳极。因此，直接的EET在BPV系统中通常不可行或效率极低，需要外源媒介来促进间接的EET。多种媒介，如蒽醌-2,6-二磺酸（AQDS）、核黄素、吩嗪和钾铁氰化物，已被用于增强生物电化学系统以实现能量生产、污染物降解和有价值产品的合成。值得注意的是，其中一些媒介在光合活性辐射（PAR）范围内（400纳米至700纳米）具有吸收能力。例如，核黄素在400-500纳米范围内有很强的吸收能力，甲基蓝在约665纳米处表现出极强的吸收能力，而铁氰化物则在约420纳米处有显著的吸收能力。因此，光照质量、蓝藻和媒介之间的相互作用增加了BPV研究的复杂性，使其成为一个有价值的研究领域。

本研究中，我们评估了一种以铁氰化物为媒介的BPV系统在不同光照条件下的性能。铁氰化物是目前唯一化学稳定性良好的人工媒介，能够支持BPV系统的持续发电。由于其通常的温和毒性和广泛的运行浓度范围，铁氰化物仍然是BPV系统中可靠和长期电子采集的关键媒介。我们使用了蓝藻孢子PCC 6803，这是一种用于光合作用研究的模式生物。我们比较了单色620纳米光照和全光谱白光在低（50微摩尔光子/平方米/秒）和高（300微摩尔光子/平方米/秒）光照强度下的影响。研究结果表明，620纳米光照在低光强下促进了更好的细胞生长，并且其能量输出与白光相当。然而，高光强白光对铁氰化物介导的BPV系统是不适用的，因为铁氰化物在强白光下分解，释放出氰化物，从而毒害细胞。此外，增加光照强度可以增强EET，作为一种能量耗散途径，但不会促进生长。为了评估该系统在实际太阳能条件下的可行性，我们进一步研究了在极高单色620纳米光照（600-1200微摩尔光子/平方米/秒）下的BPV性能，模拟了过滤后的自然阳光。这项工作提供了关于光照、微生物和媒介相互作用的机制见解，并为优化BPV系统以实现户外、可扩展的可再生能源应用奠定了基础。

研究中，我们使用了一种标准的反应器设置（图S1）来执行BPV实验，该反应器之前已经被详细描述。反应器的工作室包含一个碳布（1071HCB；Fuel Cell Store，美国）作为工作电极，其投影表面积为12.5平方厘米。为了增强表面亲水性，碳布经过在2毫摩尔CTAB溶液中于40摄氏度下浸泡16小时的预处理。一个3×7厘米的钢网（FE6210；Advent Research Materials，英国）作为对电极，而Ag/AgCl/KCl饱和电极（RE-1CP；Als，日本）作为参比电极。一个圆形的质子交换膜（9毫米直径，CMI-7000；Membranes International，美国）将工作电极和对电极室分隔开来。反应器的温度通过循环恒温器和水套维持在30摄氏度，磁力搅拌以400转/分钟的速度进行，以提高混合效率并防止细胞沉淀。空气流量通过转子流量计（B3HT S1，InFlux，英国）设置为20毫升/分钟。

在BPV反应器中，使用无菌注射器将接种物引入反应器，反应器中装有240毫升的nBG11培养基，其中含有0.5毫摩尔的铁氰化物作为媒介。反应器被接种到初始OD750约为0.5的水平。白光或红光LED外套包裹在工作电极室周围，提供50或300微摩尔光子/平方米/秒的光照强度，由恒定电压供应控制。红光预培养的细胞被接种到红光照射的反应器中，而白光预培养的细胞被接种到白光照射的反应器中。为了消除电磁噪声和环境光干扰，反应器被安置在由不锈钢板制成的法拉第笼中。BPV操作在五天内进行。使用电位计（VMP3，Bio-Logic，美国）维持工作电极电位在0.697伏（相对于SHE）并记录电流输出。

通过将测量的光电流标准化为工作电极的投影光照面积（12.5平方厘米），计算出光电流密度（微安/平方厘米）。为了评估光能利用效率，我们计算了外部量子效率（EQE），根据方程（1）进行计算。其中，Jmax是最大光电流密度（A/m2），q是电子电荷（1.602×10?1?库仑），Φ是入射光子通量，由光照强度（微摩尔光子/平方米/秒）得出。

为了评估蓝藻细胞在不同光照条件下的吸收光谱，我们使用了一台双光束分光光度计（Cary 300，Agilent Technologies，美国）配备温度控制器，测定了蓝藻细胞和0.5毫摩尔铁氰化物溶液的吸收光谱。培养液作为空白参考。所有细胞样品在测量前都被标准化为OD750为0.5。根据先前研究，我们计算了细胞的波长依赖吸收系数（a*），根据方程（2）进行计算。其中，A(λ)代表样品的波长依赖吸收；d是比色皿的路径长度，为0.01米；OD750是测量的750纳米光学密度。方程中的2.3因子用于将分光光度计通常报告的以10为底的对数吸收值转换为自然对数形式，这是因为在贝叶斯-朗伯定律的指数公式中，吸收系数通常以自然对数定义。

我们使用了光谱辐射计（CSS-45-WT，Gigahertz-Optik GmbH，德国）测量了光源的发射光谱，特别是BPV反应器中使用的白光和红光LED外套。测量在低（约50微摩尔光子/平方米/秒）和高光照强度（约300微摩尔光子/平方米/秒）下进行。通过结合光谱发射和细胞吸收光谱，我们估计了蓝藻培养液的光合活性量子吸收辐射（Qphar），根据方程（3）进行计算。其中，Qphar是光合吸收辐射（微摩尔/平方米/秒），而Q(λ)是波长依赖的光合可用量子。

在考虑铁氰化物在白光下的吸收时，我们使用方程（4）计算了光合吸收辐射。其中，Qphar是光合吸收辐射（微摩尔/平方米/秒），而Q(λ)是波长依赖的光合可用量子。我们通过积分计算了吸收光子通量与光合吸收辐射之间的关系，考虑了吸收系数的影响。

在高光照强度下，白光照射的系统中，铁氰化物浓度显著下降，从0.51毫摩尔减少到0.32毫摩尔，同时系统中积累了大量的氰化物（图3c）。细胞失活归因于氰化物的出现，一种强效的毒素。钾氰化物（KCN）是一种已知的呼吸抑制剂，通过失活终端氧化酶强烈抑制呼吸电子传递链。5毫摩尔KCN可以完全抑制氧气消耗和产生活动。此外，KCN还可能抑制光合电子传递，并潜在影响卡尔文-本森-巴斯哈（CBB）循环。

在无生物的系统中，铁氰化物在强白光下的分解速率（0.063毫摩尔/天）和氰化物生成速率（0.17毫摩尔/天）高于生物系统（0.046和0.14毫摩尔/天）。这种差异可能归因于生物系统中菌株对光的遮蔽效应，减少了媒介的光暴露。此外，菌株对短波长光的吸收也进一步减少了铁氰化物的分解。同时，生成的氰化物与细胞生物量的反应也可能降低了可检测的氰化物含量。

尽管铁氰化物在高光强白光下表现出显著的分解，但在红光下保持稳定。因此，使用光学滤光片可能为户外BPV应用提供可行的解决方案。为了初步评估这一策略，我们使用了一种代表性的商业红光滤光片（106 Primary Red，LEE Filters，英国）来研究全光谱白光和滤光后的红光之间的光谱修改和光强关系（图S7）。结果表明，虽然滤光片有效地限制了光的波长范围，但同时也导致了总光强的显著下降，这可能会限制自然阳光下的发电能力。然而，这种滤光片只是众多可能设计的光学滤光片之一，未来可能开发出能够保持较高光子通量同时提供适合BPV操作的波长选择的滤光片。

在低光强下，尽管细胞在红光下表现出更好的生长（图1d），但两种光照条件下的长期光电流表现相当，特别是在标准化为叶绿素a含量的情况下，尽管初期20小时观察到不稳定的电流（图5b, c）。这种初始电流不稳定可能归因于细胞内能量储存物质如糖原和聚羟基丁酸（PHB）的变化。这些能量储备通常通过分解途径如糖酵解和三羧酸循环（TCA cycle）释放出还原性物质，如NAD(P)H，这些物质通过光合电子传递链供电子，并参与EET，即所谓的暗电流。很可能在预培养阶段，两种菌株储存了不同成分的能量储备，导致在接种后峰值电流出现时间的差异，这可能与分解效率不同有关。然而，需要进一步研究以确认这一假设。

在高光强下，红光照射的细胞表现出显著增强的光电流生成，从约16微安/毫克叶绿素a（0.6飞安/细胞）增加到接近30微安/毫克叶绿素a（1飞安/细胞）（图5d-f）。尽管光合吸收辐射（Qphar）从35.2增加到138.4微摩尔光子/平方米/秒（表1），细胞生长并未得到改善，反而EET得到了显著增强。这表明，即使细胞吸收了更多的能量，生物量形成和CBB循环也没有被增强。高辐射可能甚至会损害这些过程，导致细胞损伤。过量的光能主要通过能量耗散途径被分散，如Mehler-like反应、非光化学猝灭和循环电子传递。最重要的是，EET可能作为辅助的电子汇，有助于在高光强压力下平衡细胞的氧化还原状态。在之前的实验中，我们发现当敲除Mehler-like反应的中介蛋白如flavodiiron蛋白时，铁氰化物介导的EET增强。铁氰化物介导的EET与flavodiiron蛋白（尤其是flv 1/3）在PSI下游竞争电子。因此，尽管EET不能完全取代Mehler-like反应，但由于其有限的容量，它仍可能作为能量耗散的辅助途径。

在没有铁氰化物的系统中，两种光强下的光电流相当，约13.9微安/毫克叶绿素a（0.34飞安/细胞）（图5h, i）。这个值值得注意，因为在低红光或白光照射下，含有铁氰化物的细胞只产生了约16微安/毫克叶绿素a的电流。蓝藻通常不能直接进行电子传递，因为它们缺乏如OmcS和MtrCAB这样的多血红素细胞色素，这些细胞色素能够促进电子从细胞膜传递到细胞外的受体。尽管某些蓝藻和藻类在无媒介的BPV系统中表现出有限的电流生成，但这些微小的电流通常归因于分泌的内源性媒介促进电子传递。因此，媒介在BPV系统中通常是不可或缺的。然而，本研究的结果表明，BPV系统有可能在无媒介的情况下运行。一个可能的解释是，在强光照下，电子传递链上的过度还原压力可能导致内源性媒介的增加，从而增强EET和光电流。

尽管在高光强单色光下，红光照射的BPV系统表现出增强的光电流，但其在模拟太阳光强度下的性能仍有待进一步验证。为此，我们扩展了研究，评估了系统在极高单色620纳米红光下的稳定性和电能产生能力。在实验中，我们使用单色620纳米光以600和1200微摩尔光子/平方米/秒的强度照射铁氰化物介导的BPV系统。首先，与300微摩尔光子/平方米/秒的光照强度类似，铁氰化物在实验期间保持稳定（图7a）。然而，与在300微摩尔光子/平方米/秒下蓝藻正常生长的情况不同，在600和1200微摩尔光子/平方米/秒的光照强度下，蓝藻的生长受到明显抑制。特别是，叶绿素a含量在1200微摩尔光子/平方米/秒下显著下降（图S10a）。这表明存在光抑制现象。尽管如此，BPV系统在两种条件下仍能保持稳定的光电流生成（图7b）。与300微摩尔光子/平方米/秒下的光电流相比，600微摩尔光子/平方米/秒和1200微摩尔光子/平方米/秒下的光电流在标准化为细胞数量或叶绿素a含量后显著增加。这些结果确认了由蓝藻驱动的铁氰化物介导的BPV系统能够在极高单色620纳米红光下稳定且高效地运行，表明其在实际太阳能条件下的应用前景。需要注意的是，这仅是对红光滤光的理论评估，实际性能将依赖于未来对滤光材料特性和长期稳定性的优化。此外，长期在光暗交替条件下运行将有助于进一步验证户外性能，特别是在考虑培养过程中物理和化学环境的动态变化时。未来的研究应聚焦于设计更高效的滤光材料、探索替代的稳定媒介，以及工程化具有更高耐受性于波动或强光条件的蓝藻菌株。这些研究将推动我们对光、微生物和媒介之间相互作用的理解，并为开发耐用的太阳能驱动BPV技术提供实际的见解。