利用“推拉”合成代谢工程策略开发富含甜菜碱胚乳的eRUBY玉米

《Crop and Environment》：Development of eRUBY maize with betalain-enriched endosperm using a push-and-pull synthetic metabolic engineering strategy

玉米胚乳中betalain生物合成增强及代谢调控研究。采用聚核糖体表达和代谢流调控的推拉式多基因策略，整合CYP76AD1、DODA1、DOPA5GT和ADHα基因，通过端粒特异性启动子PGT1实现高效表达。构建CDGA单顺式融合体和CDG+A独立表达体，发现CDGA因ADHα与RUBY系统的协同作用，使betanin和isobetanin含量分别达6.88和1.81 mg/g干重，较野生型提高2.85-7.58倍，且不影响植株正常生长。转录组与代谢组分析揭示苯丙氨酸、天冬氨酸等代谢途径的显著重构，并发现多拷贝T-DNA与基因表达正相关。通过杂交开发出高betalain（11.40 mg/g）和高糖（葡萄糖、果糖、蔗糖含量提升）的甜玉米新种质ZCDGA。

　　本研究聚焦于一种重要的天然植物色素——类黄质（Betalain）在转基因玉米胚乳中的高效合成。类黄质因其强大的抗氧化能力，不仅在食品工业中被广泛应用，还被视为植物转基因筛选的视觉标记工具。然而，当前市场对类黄质的需求远超其生产能力，这促使科学家们寻求更高效的合成方法。本研究通过构建一种多基因策略，结合多顺反子表达和代谢通量调控，显著提高了玉米胚乳中类黄质的合成效率，为农业生物技术在提高作物营养价值方面提供了新的思路。

类黄质主要分为两大类：类黄质色素（Betalain）和类黄质类物质（Betaxanthin），其中betanin和isobetanin是其主要的生物合成产物。这些物质的合成依赖于一系列关键酶的协同作用，包括酪氨酸脱羧酶（CYP76AD1）、酪氨酸4,5-双氧酶（DODA1）和环-DOPA-5-葡萄糖基转移酶（DOPA5GT）。然而，传统方法在类黄质合成过程中面临一些挑战，例如，由于反馈抑制机制，限制了前体物质的供应，进而影响了最终产物的积累。为了解决这一问题，研究团队引入了一种反馈抑制敏感性较低的类黄质合成相关酶——ADHα（苯丙氨酸前体转化酶），以提高酪氨酸的供应效率，从而推动类黄质的合成过程。

在构建转基因体系时，研究团队采用了多顺反子表达策略，将CYP76AD1、DODA1、DOPA5GT和ADHα四个基因融合为一个单一的表达单元（eRUBY），并使用玉米胚乳特异性启动子PGT1驱动其表达。这种方法不仅简化了基因表达调控，还增强了整个合成通路的稳定性。此外，为了进一步提高类黄质的合成效率，研究团队还设计了两种不同的表达方式：一种是将ADHα与RUBY基因串联在同一表达单元中（CDGA），另一种则是将ADHα与RUBY基因分别由独立的启动子控制（CDG + A）。结果显示，CDGA表达系统在类黄质的合成效率上显著优于CDG + A系统，这可能与启动子的高效性、基因表达的协调性以及代谢通量的优化有关。

实验中，研究团队通过高通量液相色谱（HPLC）检测了转基因玉米胚乳中类黄质的含量，并与野生型玉米进行了比较。结果表明，CDGA转基因玉米的betanin含量达到了6.88 mg/g干重，而isobetanin含量为1.81 mg/g干重，显著高于CDG + A转基因玉米的betanin（0.90 mg/g干重）和isobetanin（约0.54 mg/g干重）。此外，通过抗氧化活性测定，研究团队发现CDGA转基因玉米的抗氧化能力比野生型玉米提高了2.85到7.58倍，而CDG + A转基因玉米则提升了2.48到2.80倍。这说明，通过优化代谢通量，CDGA系统在提升类黄质含量和抗氧化能力方面表现更为出色。

进一步的转录组和代谢组分析揭示了类黄质合成对玉米胚乳中苯丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路的深远影响。研究发现，这些氨基酸代谢相关的基因表达水平在转基因玉米中发生了显著变化，表明类黄质的合成不仅依赖于特定的酶系统，还与整体代谢网络的调整密切相关。例如，类黄质的合成消耗了L-酪氨酸这一关键前体，同时促进了其他代谢通路中相关物质的积累。此外，研究团队还通过多组学分析（包括转录组、代谢组和基因组）对CDGA和CDG + A两种表达系统进行了比较，发现CDGA系统在基因表达水平和代谢产物积累方面具有明显优势。

为了进一步提升转基因玉米的食用品质和市场竞争力，研究团队还尝试将CDGA系统与甜玉米品种进行杂交，生成了一种新型的高糖类黄质玉米品种（ZCDGA）。这一品种不仅保留了类黄质的高合成能力，还表现出更高的糖分含量，包括葡萄糖、果糖和蔗糖。实验数据显示，ZCDGA的糖含量显著高于野生型甜玉米和普通转基因玉米，这可能与其基因组中多拷贝的T-DNA结构有关。同时，该品种在形态上表现出正常的生长状态，没有出现明显的生长缺陷，这表明类黄质的合成并未对植物整体生长造成负面影响。

研究团队还探讨了类黄质合成对玉米代谢网络的潜在影响。通过比较不同转基因玉米品种与野生型玉米的代谢产物，他们发现CDGA系统在多个代谢通路中表现出更高的代谢活性，包括苯丙氨酸代谢、糖代谢和抗氧化代谢等。这些发现不仅有助于理解类黄质合成的分子机制，也为未来开发更高产量的类黄质作物提供了理论依据。此外，研究团队还提出了进一步优化的策略，例如在CDGA系统中引入额外的DODA1基因拷贝，以缓解代谢通路中的瓶颈效应，从而实现更高的类黄质合成效率。

总体而言，本研究通过构建多基因系统，结合多顺反子表达和代谢通量调控，成功提高了玉米胚乳中类黄质的合成水平。这不仅为功能性食品的开发提供了新的原料来源，还为农业生物技术在提高作物营养价值方面提供了可行的解决方案。同时，研究还揭示了类黄质合成与植物代谢网络之间的复杂关系，为后续研究奠定了基础。通过将类黄质合成与高糖性状结合，研究团队开发出了一种兼具营养价值和口感优势的新型玉米品种，为未来农业育种提供了重要的参考价值。