来自Streptococcus parauberis的细胞外囊泡有助于高效递送LL37，并增强其抗菌活性

《Fish & Shellfish Immunology》：Extracellular Vesicles from Streptococcus parauberis Facilitate the Efficient Delivery of LL37 with Enhanced Antibacterial Activity

连续与间歇口服灭活Vibrio harveyi疫苗对凡纳滨对虾免疫影响及机制研究，结果显示连续给药组14天存活率骤降至-22.73%并伴随肠道组织坏死，而间歇给药组存活率维持60%以上，免疫酶活性更高，肠道菌群中Ruegeria属比例显著增加，蛋白质组学分析揭示连续给药导致能量代谢等通路下调。

　　本研究探讨了针对对虾（*Penaeus vannamei*）增强对副溶血弧菌（*Vibrio*）抵抗力的最优口服疫苗接种策略。通过比较两种喂养方案：连续给予灭活副溶血弧菌（IVH）（CF组）和间歇式IVH喂养（7天IVH后7天使用商业饲料，IF组），研究人员发现，7天的IVH喂养能够有效诱导抗副溶血弧菌的免疫力。在挑战试验中，IF组在接种后14天、21天和28天时保持超过60%的相对存活率（RPS），而CF组则在14天时出现显著的RPS下降，降至-22.73%，并且后续数值持续偏低。此外，CF组的特定生长率相比对照组明显降低。在14天的免疫酶活性分析中，IF组表现出持续高水平的免疫活性，而CF组则出现了明显的下降。组织病理学检查确认了CF组在14天时肠道和肝胰腺组织出现严重的细胞坏死现象。肠道微生物群分析表明，两组在14天时的主导菌群相似，但IF组中* Ruegeria*属的比例更高。蛋白质组学分析则揭示了两组之间存在不同的表达模式，CF组中与能量代谢、免疫反应、代谢途径以及细胞和组织维持相关的蛋白质显著下调。这些数据表明，连续给予IVH疫苗会引发显著的生理压力，导致细胞和组织损伤，从而引起免疫抑制；而间歇式喂养则能缓解免疫损伤，赋予对*V. harveyi*的抵抗力。本研究强调了在对虾水产养殖中，制定时间优化的疫苗接种方案的重要性。

全球水产养殖产量在2022年达到了历史性的13090万吨，相比2020年的12280万吨增加了810万吨。对虾（*Penaeus vannamei*）在甲壳类动物中占比最高，达到62.2%，产量为7934千吨，紧随其后的是红沼虾（23.3%）（FAO，2024）。*P. vannamei*是世界上第六大水产养殖物种，是人类重要的蛋白质来源。然而，对虾容易受到细菌、病毒和真菌等病原体的感染，其中细菌和病毒感染对水产养殖的生产率构成了最大威胁。代表性细菌为副溶血弧菌（*Vibrio harveyi*），该菌在对虾养殖中是重要的致病因素，导致一种称为发光弧菌病的疾病，其特征是全身感染和生物发光病变。

在水产养殖系统中，细菌病原体的管理采用了多种干预策略。目前的方法包括抗菌药物、噬菌体疗法、活菌补充（益生菌）及其协同组合、免疫接种方案以及免疫调节物质。尽管有多种方法，抗菌药物仍然是对虾养殖中的主要手段，因其见效快。然而，在现代水产养殖操作中，抗菌药物的广泛使用引发了三个关键问题：（1）抗菌药物耐药性细菌的出现；（2）抗菌药物在水生食物链中的生物累积；（3）对海洋微生物生态系统的破坏。这些问题凸显了开发可持续替代方案的必要性，这些方案能够在保持治疗效果的同时，兼顾生态系统的保护。

对虾具有独特的适应性免疫系统，其免疫记忆形式较为简化，使得疫苗接种成为增强免疫力的一种可行策略。对虾疫苗的研究始于20世纪80年代，疫苗类型包括灭活疫苗、亚单位疫苗和减毒疫苗。通过将灭活副溶血弧菌（*Vibrio anguillarum*）作为饲料补充，能够提高*Penaeus monodon*的总血细胞数和类过氧化物酶水平，同时改善商业对虾的产量。利用噬菌体展示技术衍生的VP28蛋白重组疫苗，能够达到最高44.99%的相对保护率。通过敲除LpxD基因的副溶血弧菌，可以作为口服减毒疫苗，将*P. vannamei*的死亡率从66%降低至27%。灭活副溶血弧菌疫苗具有生产简便、成本低廉和稳定性强的优势。疫苗的给药途径包括口服、注射和浸泡，其中口服方式在操作上较为简便，劳动效率高。肠道吸收研究表明，中肠是抗原摄取和处理的主要部位。目前对虾中关于灭活副溶血弧菌疫苗的研究采用了不同的免疫接种策略和实验持续时间。值得注意的是，48小时的口服疫苗未能在*Penaeus indicus*中提供保护，而含有/不含羧甲基β-1,3-葡聚糖（CMBG）的疫苗则通过血细胞增殖和功能增强，在*Penaeus monodon*中表现出保护效果。通过浸泡方式给予的热灭活和甲醛灭活副溶血弧菌疫苗在*P. monodon*中也显示出显著的保护率。将灭活副溶血弧菌疫苗与* Bacillus subtilis*（1:1比例）进行肌肉注射，能够特异性增强抗副溶血弧菌的吞噬活性，且不会对* B. subtilis*产生交叉反应，表明细胞免疫具有特异性。尽管已有研究展示了不同的免疫保护效果，但在连续与间歇喂养方案的比较分析及其对免疫保护机制的时间影响方面仍存在关键空白。

本研究对灭活副溶血弧菌（IVH）疫苗的接种方案、效果及机制进行了全面调查。建立了三个实验组：连续喂养组、间歇喂养组和对照组。通过系统评估实验阶段的免疫保护效果，并利用酶活性分析、组织病理学检查以及对虾肠道微生物群的整合宏基因组-蛋白质组分析，揭示了免疫保护机制。值得注意的是，本研究是首次在甲壳类动物中记录连续口服副溶血弧菌疫苗会引发免疫抑制效果，而间歇喂养方案则能显著缓解这种免疫抑制，同时维持强大的保护免疫力。

对虾在生物学系统中缺乏特异性免疫，仅具有先天免疫机制。免疫刺激剂可以增强非特异性免疫，促进生长，降低水产动物的饲料转化率。例如，*Urtica dioica L.*能够增强幼年虹鳟鱼的生长、先天免疫和对细菌疾病的抵抗力。*Geniposide*的给药显著提高了关键免疫参数，包括溶菌酶活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化氢酶活性。免疫刺激剂的合理使用可以提升水产动物的生长性能，增强非特异性免疫，减少抗生素的使用。然而，免疫刺激剂的不合理使用可能对水产动物产生负面影响，如免疫耐受和免疫功能障碍。因此，免疫刺激剂的使用方式，如连续或间歇式给药，可能对不同的水产动物产生不同的效果。连续给予β-葡聚糖和甘草甜味剂可能在*P. vannamei*中诱导免疫耐受，此时超氧化物歧化酶、总血细胞数和超氧化物阴离子的水平不再显著高于对照组。而间歇喂养或交替使用两种免疫刺激剂则能够消除免疫疲劳。长期高剂量的饲料葡聚糖（Macrogard?）会降低非洲鲶鱼的吞噬作用和细菌清除能力。因此，需要进行全面评估，以确定连续或间歇式给药是否能够引发宿主的免疫保护，或者相反地导致免疫耐受及相关不良影响。

在本研究中，研究人员对灭活副溶血弧菌（IVH）疫苗的接种方案、效果及机制进行了深入探讨。实验设计包括连续喂养、间歇喂养和对照组三个组别。通过标准化的肌肉注射挑战试验，评估了不同口服接种方案对对虾抗副溶血弧菌免疫力的影响。挑战试验中使用了具有致病性的副溶血弧菌菌株，并在预定的时间点进行评估。实验结果显示，间歇式喂养组在接种后14天、21天和28天的相对存活率均高于60%，而连续喂养组则在14天时出现了显著的存活率下降，降至-22.73%，并且后续数值持续偏低。此外，连续喂养组的特定生长率显著低于对照组。在14天的免疫酶活性分析中，间歇式喂养组表现出持续高水平的免疫活性，而连续喂养组则出现了明显的下降。组织病理学检查确认了连续喂养组在14天时肠道和肝胰腺组织出现了严重的细胞坏死现象。肠道微生物群分析表明，两组在14天时的主导菌群相似，但间歇式喂养组中*Ruegeria*属的比例更高。蛋白质组学分析则揭示了两组之间存在不同的表达模式，连续喂养组中与能量代谢、免疫反应、代谢途径以及细胞和组织维持相关的蛋白质显著下调。这些数据表明，连续给予IVH疫苗会引发显著的生理压力，导致细胞和组织损伤，从而引起免疫抑制；而间歇式喂养则能缓解免疫损伤，赋予对*V. harveyi*的抵抗力。本研究强调了在对虾水产养殖中，制定时间优化的疫苗接种方案的重要性。

对虾的免疫系统与其它动物存在显著差异，其主要依赖于先天免疫机制。这种免疫系统缺乏像哺乳动物那样的适应性免疫，因此，疫苗接种成为增强其免疫力的重要手段。在对虾养殖中，合理的疫苗使用不仅可以提升其对病原体的抵抗力，还能够促进生长，减少抗生素的依赖。然而，疫苗的使用方式对免疫效果有着重要影响，不同的接种方案可能导致不同的免疫反应。例如，连续给予某些免疫刺激剂可能会导致免疫耐受，而间歇式给予则能够避免这种现象。因此，研究不同接种方案对免疫效果的影响，对于优化对虾养殖中的疫苗应用具有重要意义。

本研究通过比较连续和间歇式给予灭活副溶血弧菌疫苗的效果，揭示了这两种方式对对虾免疫系统的影响。实验结果显示，间歇式喂养不仅能够维持较高的免疫活性，还能够有效提高对病原体的抵抗力。相比之下，连续喂养则会导致免疫活性的下降，甚至引发免疫抑制。这些发现对于水产养殖中的疫苗接种策略具有指导意义，表明在实际操作中应采用间歇式接种方案，以避免免疫系统的过度负担和潜在的负面影响。此外，研究还表明，肠道微生物群在对虾的免疫调节中起着重要作用，不同的接种方案可能会影响其组成和功能。因此，在制定疫苗接种方案时，应综合考虑免疫效果和肠道微生物群的动态变化。

在水产养殖中，疫苗的使用不仅需要考虑其对宿主的免疫保护效果，还需要评估其对生态环境的潜在影响。例如，某些疫苗的使用可能会改变水体中的微生物群落结构，进而影响整个生态系统的稳定性。因此，在开发和推广疫苗时，应充分考虑其生态影响，并采取相应的措施来减少对环境的干扰。同时，疫苗的生产成本和稳定性也是重要的考量因素，需要在实际应用中找到平衡点。

本研究的结果对于水产养殖业具有重要的实践意义。首先，它表明在对虾养殖中，间歇式疫苗接种方案比连续接种更有效，能够维持较高的免疫活性和保护效果。其次，研究发现连续接种可能会引发免疫抑制，导致对虾的生长率下降和疾病易感性增加。这些发现为水产养殖业提供了新的思路，即在疫苗接种过程中，应根据对虾的生理状态和免疫需求，采用适当的接种方案，以达到最佳的免疫效果。此外，研究还强调了在疫苗接种过程中，应注重免疫系统的动态变化，避免过度刺激或抑制，以维持对虾的健康和生长。

综上所述，本研究通过系统比较连续和间歇式给予灭活副溶血弧菌疫苗的效果，揭示了这两种方式对对虾免疫系统的影响。研究结果表明，间歇式喂养能够有效提高对虾的抗病能力，而连续喂养则可能导致免疫系统的损害。因此，在对虾养殖中，应优先考虑采用间歇式疫苗接种方案，以确保免疫效果的同时，减少对环境和宿主健康的潜在影响。此外，研究还强调了在疫苗接种过程中，应注重免疫系统的动态变化，避免过度刺激或抑制，以维持对虾的健康和生长。这些发现为水产养殖业提供了重要的参考，有助于优化疫苗接种策略，提高对虾养殖的可持续性和经济效益。