双组分系统CseB-C在链霉菌（Streptomyces rapamycinicus）中参与雷帕霉素（rapamycin）和油菜苷（elaiophylin）生物合成的差异调控

《Food Bioscience》：Involvement of two-component system CseB-C in differential regulation of rapamycin and elaiophylin biosynthesis in Streptomyces rapamycinicus

本研究利用深度学习工具DLKcat筛选出高温稳定蛋白酶BSnpr，通过优化枯草芽孢杆菌的表达系统（Pshuttle09和SPybbE），结合定向进化（活性提升1.25倍）和理性设计（G272S突变），获得工程菌株BSN-3。其发酵酶活达696.47 U/mL，应用于鱼饲料水解时保持87.6%-91.6%的氨基酸释放率，为水产饲料工业提供高效酶策略。

　　在当前的全球背景下，对可持续动物蛋白来源的需求不断上升，这对畜牧业生产体系提出了更大的压力。动物饲料作为生产链中的一个显著资源密集型环节，其重要性日益凸显。因此，开发高效、稳定的饲料蛋白酶成为提升饲料营养价值和促进经济与环境可持续性的关键。蛋白酶在饲料中发挥着重要作用，它能够提高蛋白质的消化率，改善氨基酸的利用率，从而对动物健康和生产效率产生积极影响。然而，这些蛋白酶在工业应用中常常面临挑战，特别是在高温制粒过程中，需要酶具备高催化活性和良好的热稳定性。

传统的酶发现方法通常依赖于对微生物库进行耗时的筛选。近年来，计算生物学的进步，尤其是深度学习技术的应用，为这一过程带来了革命性的变化。深度学习工具如DLKcat和NNKcat能够快速筛选庞大的序列数据库，识别具有高催化潜力的酶，从而实现对新型候选酶的精准发现。DLKcat是一种基于深度学习的算法，它能够直接从氨基酸序列中计算催化周转数（kcat）值。通过这种方法，研究者能够预测酶的催化效率，并据此筛选出具有高催化潜力的候选序列。

在本研究中，我们采用DLKcat工具从公共蛋白质数据库中筛选出10,000个候选序列，并评估它们的催化效能。最终，我们选择了来自不同细菌物种的三种蛋白酶作为主要候选：来自Bacillus glycinifermentans的BGnpr、来自Bacillus stratosphericus LAMA 585的BSLnpr，以及来自Bacillus spizizenii的BSnpr。这些候选序列在预测催化效能方面表现优异，为后续的蛋白工程和表达系统优化提供了高质量的起点。

为了进一步提升这些候选蛋白酶的性能，我们构建了一个高效的表达平台。通过优化启动子和信号肽，我们提高了BSnpr在Bacillus subtilis SCK6中的表达水平。启动子的优化是提高蛋白酶产量的关键因素之一，而信号肽的正确选择则能够促进蛋白酶的分泌，使其在细胞外发挥更高的活性。在本研究中，我们使用了Pshuttle09启动子和SPybbE信号肽，这两个元件在之前的实验中已被证明能够显著提升蛋白酶的表达和分泌效率。

在构建表达平台的基础上，我们采用了两阶段的蛋白工程策略来提升酶的性能。首先，通过定向进化技术，我们提高了BSnpr的催化活性。定向进化是一种模拟自然选择过程的方法，它通过多次突变和筛选，逐步优化酶的特性。在本研究中，定向进化使BSnpr的催化活性提高了1.25倍。随后，我们采用理性设计方法，对BSnpr进行了定点突变，其中G272S突变显著提升了其热稳定性。经过这一系列优化，最终获得了BSnpr-3这一变体，该变体在60°C下保持了1.07倍的催化活性，相较于原始菌株。

为了实现大规模生产，我们采用了7 L的发酵罐进行BSnpr-3的培养。在发酵过程中，我们通过优化培养条件和调控发酵过程，确保BSnpr-3能够高效地分泌到细胞外，并达到较高的活性水平。最终，BSnpr-3在7 L发酵罐中实现了696.47 U/mL的细胞外活性，这表明该变体具有良好的工业应用潜力。

在实际应用中，BSnpr-3被用于鱼饲料的水解处理。经过60°C和70°C的预处理，BSnpr-3的氨基酸释放水平分别达到了91.6%和87.6%，相较于对照组表现出显著的提升。这一结果表明，BSnpr-3不仅具备高催化活性，而且在高温条件下仍能保持较高的稳定性，从而满足工业鱼饲料生产的需求。

本研究的成果为开发高性能蛋白酶提供了一种有效的策略。通过结合深度学习技术、表达系统优化和结构导向的蛋白工程，我们成功地提升了BSnpr的催化性能和热稳定性。这一综合方法不仅提高了酶的工业应用价值，也为未来的生物技术研究提供了新的思路。此外，本研究还强调了在工业应用中，蛋白酶的高产量和稳定性是实现其广泛应用的关键因素。通过优化表达元件和采用先进的蛋白工程技术，我们能够确保蛋白酶在实际生产过程中具备良好的性能。

在本研究中，我们不仅关注蛋白酶的性能提升，还注重整个研究流程的系统性和高效性。从候选序列的筛选到最终酶的生产，我们构建了一个完整的流程。这一流程包括深度学习技术用于候选序列的筛选、表达系统优化用于提高蛋白酶的产量和分泌效率，以及结构导向的蛋白工程用于进一步提升酶的性能。通过这一系列优化，我们成功地获得了BSnpr-3这一变体，并在实验中验证了其在鱼饲料水解中的高效性。

本研究的创新点在于将深度学习技术与传统的蛋白工程方法相结合，从而实现对蛋白酶的高效筛选和优化。深度学习技术的应用使得我们能够在短时间内筛选出具有高催化潜力的候选序列，而传统的蛋白工程方法则能够进一步提升这些候选酶的性能。这种综合方法不仅提高了研究效率，还为未来的生物技术研究提供了新的方向。

此外，本研究还强调了在工业应用中，蛋白酶的高产量和稳定性是实现其广泛应用的关键因素。通过优化表达系统，我们能够确保蛋白酶在实际生产过程中具备良好的性能。在本研究中，我们采用了Bacillus subtilis SCK6作为表达宿主，该菌株是一种公认的GRAS（一般认为安全）菌株，广泛用于工业蛋白酶的生产。其优势在于能够高效分泌蛋白酶，并且对下游处理的要求较低。通过优化启动子和信号肽，我们显著提高了BSnpr的表达水平和分泌效率，从而实现了高产量的蛋白酶生产。

在实验过程中，我们还采用了一系列生物技术手段，包括基因克隆、蛋白表达和酶活性检测。通过基因克隆，我们将BSnpr的基因与Pshuttle09启动子和SPybbE信号肽结合，构建了高效的表达载体。在蛋白表达过程中，我们通过优化培养条件和调控发酵过程，确保BSnpr-3能够高效地分泌到细胞外，并达到较高的活性水平。在酶活性检测中，我们通过模拟实际生产条件，评估BSnpr-3在高温下的催化性能，从而验证其在工业应用中的潜力。

本研究的成果不仅为开发高性能蛋白酶提供了有效的策略，还为未来的生物技术研究奠定了基础。通过结合深度学习技术、表达系统优化和结构导向的蛋白工程，我们成功地提升了蛋白酶的性能，使其能够满足工业应用的需求。此外，本研究还强调了在生物技术研究中，系统性和高效性的重要性。通过构建完整的流程，我们能够确保蛋白酶的性能提升和大规模生产，从而实现其在实际应用中的价值。

总的来说，本研究通过深度学习技术筛选出具有高催化潜力的候选蛋白酶，并通过优化表达系统和采用蛋白工程策略，进一步提升了其性能。最终获得的BSnpr-3变体不仅在催化活性和热稳定性方面表现出色，而且在实际应用中展现出良好的效果。这一成果为工业鱼饲料生产提供了一种新的解决方案，同时也为未来的生物技术研究提供了新的思路和方法。