葡萄黑腐病病原菌 Phyllosticta ampelicida 挑战下叶际微生物组结构与功能预测的代谢条形码分析

《Microbial Ecology》：Metabarcoding Profiling Reveals Microbiome Structure and Predicts Functional Shifts in Grapevines Challenged by Phyllosticta ampelicida

本研究针对葡萄黑腐病（BRD）病原菌 Phyllosticta ampelicida 对葡萄叶际微生物组的影响展开研究。通过代谢条形码技术，研究人员发现，尽管患病植株的微生物多样性和丰富度指数无显著差异，但其微生物网络结构发生显著改变，并观察到 Acinetobacter 等有益菌的相对丰度增加，提示宿主可能通过招募有益微生物来应对生物胁迫。此外，患病植株中抗生素抗性相关KEGG Orthologues（KOs）的丰度更高，这对人类健康构成潜在担忧。该研究首次揭示了葡萄黑腐病对葡萄叶际附生细菌微生物组结构的影响，为理解植物-微生物互作提供了新见解。

　　

葡萄（Vitis vinifera）是全球重要的经济作物，尤其在欧洲的西班牙、法国、意大利、葡萄牙等国家，其葡萄种植面积约占全球的一半，在中国、土耳其、智利和南非等国也占有重要地位。然而，葡萄的健康和生产力常常受到多种真菌疾病的威胁，包括白粉病、枝干病害、灰霉病和黑腐病等，这些病害严重影响了葡萄园的产量和寿命，造成了巨大的经济损失。其中，黑腐病（Black rot disease, BRD）是由 Phyllosticta ampelicida（Guignardia bidwellii 的无性形态）引起的一种病害，它是一种半活体营养型子囊菌，能够侵染葡萄的绿色组织。该真菌通过分生孢子附着在葡萄表面，形成附着胞，从而绕过宿主的表面防御，侵入表皮细胞。进入植物组织后，P. ampelicida 合成多种碳水化合物活性酶（CAZymes）来降解细胞壁多糖。随着菌丝伸长，症状开始出现，表现为圆形病斑，中心浅褐色，边缘深褐色，随后形成分生孢子器。在叶柄上， elongated dark lesions 也会产生分生孢子器。受感染的葡萄最初出现浅褐色凹陷斑点，在3-4天内，果实干瘪，变成蓝褐色，并显示分生孢子器的存在。

目前，黑腐病的治理策略包括使用铜基或硫基杀菌剂。然而，在有机农业系统中，传统杀菌剂的使用受到限制，可用的生态替代方法迄今为止对控制 P. ampelicida 的传播效果不佳。尽管黑腐病的易感性因葡萄品种而异，但所有商业上重要的品种都被认为是易感的。

尽管黑腐病的流行程度不断增加，但关于 P. ampelicida 如何影响葡萄相关微生物群落，尤其是附生微生物群落的了解甚少。最近的研究表明，植物健康不仅由病原体决定，还受到宿主微生物组的影响，微生物组可以促进养分吸收，增强对非生物和生物胁迫的耐受性，并有助于抑制疾病。这些群落高度动态，能够快速响应病原体攻击和微气候的变化。因此，全息生物（holobiont）的功能不能仅从单个微生物类群的存在或缺失来推断。

在这一背景下，尽管根际已被广泛研究，但叶际（phyllosphere）却很少受到关注，尽管它是植物与大气环境的直接界面，并可能在群落水平上对植物健康产生影响。值得注意的是，最近的研究表明，叶际微生物群落可以增强宿主对叶部病原体的抵抗力。此外，病原体攻击可以诱导植物相关微生物组（包括叶际）的显著变化，改变其分类组成和功能潜力。这对于附生微生物群落尤为重要，因为它们是抵御叶部病原体的第一道防线。附生微生物群可以影响病原体在植物表面定殖和组织中有效定殖的能力，在感染的早期阶段起着关键作用。此外，附生群落的状态常被视为植物健康的指标，因为它对环境条件和农业实践高度敏感。因此，一些研究表明，微气候条件的变化可以影响附生微生物群落和宿主对病原体的易感性。

微生物群落结构和功能的这些失衡，通常由生物或非生物胁迫驱动，统称为菌群失调（dysbiosis）。在叶际，菌群失调与α多样性降低、从厚壁菌门（Firmicutes）主导转变为变形菌门（Proteobacteria）丰富的群落以及叶组织褪绿或坏死病变的发展有关。一些研究进一步报道了叶际内生菌（endophytes）在应对病原体挑战时丰度增加。值得注意的是，移植实验表明，将健康植物接种失调的叶际群落可以诱导组织损伤，这表明菌群失调本身可以直接损害宿主健康。

然而，微生物组的转变并不总是导致负面结果。在某些情况下，病原体诱导的变化可能导致改良菌群（meliorbiosis），即宿主通过招募有益微生物来增强对胁迫的恢复力，从而产生积极反应的状态。改良菌群通常与对次级病原体的抵抗力提高或植物活力增强有关，通常是通过选择性富集保护性微生物类群实现的。支持这一点的是，最近的研究强调，受胁迫的植物可以改变其渗出物谱以选择性招募有益微生物。此外，在水稻叶际，受稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）感染的叶片据报道通过代谢变化招募有益细菌（例如 Pantoea），并最终抑制病原体。

尽管植物-微生物相互作用在过去几年中受到密切关注，但大多数农业上重要的病理系统仍然知之甚少。特别是，P. ampelicida 感染对葡萄微生物组的影响仍然未知。尚不清楚在病原体压力下，宿主微生物组是否面临菌群失调，或者 Vitis vinifera 是否可以通过选择性招募有益微生物来建立改良菌群反应。

因此，在本研究中，我们假设 P. ampelicida 的感染会诱导葡萄叶际微生物组的转变，导致（a）多样性降低和机会性类群丰度增加（菌群失调），或（b）与疾病抑制相关的特定有益微生物类群的富集（改良菌群）。因此，我们旨在表征 P. ampelicida 挑战下 V. vinifera 的微生物组，以确定宿主是否招募有益微生物来对抗感染，或者相反，进入可能增加对其他病原体和害虫脆弱性的菌群失调状态。

为了开展这项研究，研究人员从葡萄牙杜罗河地区的三个商业化葡萄园中，选取了显示黑腐病症状和无症状的“国产多瑞加”（Touriga Nacional）葡萄植株进行采样。通过特异性PCR确认了病原菌的存在。利用16S rRNA基因V3-V4区的高通量测序技术分析了叶际附生细菌群落。通过生物信息学分析，包括α和β多样性分析、微生物网络构建以及PICRUSt功能预测，揭示了微生物群落结构、相互作用和功能潜力的变化。

研究结果首先通过PCR确认了所有 symptomatic 样本中 P. ampelicida 的存在，而在无症状样本中未检测到该病原菌。

代谢条形码数据显示，Illumina测序产生了大量高质量序列，最终获得29,823个操作分类单元（OTUs）。

在微生物群落结构方面，α多样性分析表明，患病植株与健康植株的丰富度（Chao1）和多样性（Shannon）指数均无统计学显著差异，但患病植株显示出多样性和丰富度降低的趋势。

在门水平上，健康葡萄植株的变形菌门（Proteobacteria）和蓝藻门（Cyanobacteria）相对丰度较低，而放线菌门（Actinobacteriota）、粘球菌门（Myxococcota）和拟杆菌门（Bacteroidota）的相对丰度较高。

Venn图分析显示，健康植株拥有更多独特的OTUs。

β多样性分析（PCoA）未显示健康与患病植株微生物群落的明显分离。

差异丰度分析发现 Luteibacter 和 Scytonema 在患病植株中富集，而 Acinetobacter 在健康植株中更丰富。

微生物相互作用网络分析显示，患病植株的核心类群（core taxa）和枢纽类群（hub taxa）数量减少，正负相互作用也减少，群落模块性发生变化。

功能预测（PICRUSt）表明，患病植株中抗生素抗性相关KOs丰度更高，而健康植株中与多药外排泵、生物膜形成和信号转导通路相关的KOs更丰富。

本研究首次揭示了 P. ampelicida 感染如何改变葡萄叶际附生细菌群落的结构和功能。研究结果表明，在真菌攻击下，葡萄植株可能招募有益微生物类群（如 Acinetobacter），作为改良菌群反应的一部分，以帮助减轻病原体影响。相比之下，健康植株维持着一个富含已知具有生物防治潜力类群的微生物组。此外，我们观察到患病植株中抗生素抗性KOs的丰度更高，这从公共人类健康的角度提出了新的担忧。这些发现强调需要进一步研究病原体驱动的微生物组重组在农业生态系统中的生态后果及其在植物-土壤-人类健康连续体中的潜在影响。该研究为理解植物-微生物在胁迫条件下的互作提供了新的见解，并指出了未来生态防治策略的潜在靶点。