调节性T细胞分泌组通过旁分泌信号驱动骨髓间充质基质细胞成骨分化机制研究

《Stem Cell Reviews and Reports》：Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cell Osteogenesis is driven by Paracrine signals from Regulatory T Cell

本研究针对骨再生过程中调节性T细胞（Treg）对骨髓间充质基质细胞（BMSC）成骨分化调控机制不清的问题，通过收集健康人源Treg条件培养基（Treg-CM），系统评估其对BMSC代谢、迁移及成骨分化的影响。研究发现50μg/mL Treg-CM可显著上调BMSC成骨关键基因（SP7、SPP1等）表达，增强碱性磷酸酶（ALP）活性并促进钙沉积。蛋白质组学揭示Treg-CM富含调控细胞骨架动态、代谢过程及mRNA翻译的独特蛋白，细胞因子谱分析显示其通过MIP-1α、G-CSF等免疫调节因子协同作用，为开发无细胞骨再生策略提供新见解。

　　

骨骼再生是一个由免疫系统与骨骼系统相互作用调控的复杂过程。近年来，免疫细胞在骨修复中的作用日益受到关注，其中调节性T细胞（Treg）作为CD4⁺ T细胞的特化亚群，不仅参与免疫调节，更被证实可通过与祖细胞相互作用促进骨再生。然而，Treg如何直接调控骨髓间充质基质细胞（BMSC）的成骨分化，其具体分子机制尚不明确。现有研究多聚焦于Treg对破骨细胞的抑制作用，或BMSC对Treg功能的调控，而对Treg分泌组（secretome）直接影响BMSC成骨能力的探索仍存在空白。此前仅有研究使用诱导性Treg（iTreg）进行共培养，发现其对碱性磷酸酶（ALP）活性的促进作用有限，且未能系统揭示其作用机制。因此，深入解析天然Treg分泌组对BMSC成骨分化的调控作用，对于开发新型骨再生治疗策略具有重要意义。

为解决上述问题，挪威卑尔根大学临床牙科系Salwa Suliman团队在《Stem Cell Reviews and Reports》发表了最新研究。该研究从6名健康供者外周血中分离天然Treg，经13天扩增后收集Treg条件培养基（Treg-CM），并利用3名健康供者髂嵴来源的BMSC，通过蛋白质浓度标准化（50μg/mL）体系，综合评估Treg-CM对BMSC代谢活性、细胞迁移、成骨基因表达、ALP活性及基质矿化的影响。关键技术包括：流式细胞术鉴定细胞表型、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行非标记定量蛋白质组学分析、多重荧光免疫法检测细胞因子、实时定量PCR（RT-qPCR）分析成骨基因表达、以及ALP染色/Alizarin Red S（ARS）染色定量 mineralization 等。

TexMACS培养基优化Treg培养并剂量依赖性限制BMSC生长

研究首先优化了Treg扩增条件，发现TexMACS培养基较传统RPMI培养基更能维持Treg的细胞活力与表型稳定性（CD4⁺CD127^dim/-CD25⁺FOXP3⁺）。

透射电镜显示TexMACS组Treg形成更致密的细胞簇。而BMSC在TexMACS中呈现剂量依赖性的代谢活性降低与STRO-1表达下降，提示高浓度TexMACS可能影响BMSC干性。

Treg-CM调控BMSC形态与迁移模式

通过浓度梯度实验确定50μg/mL Treg-CM为最佳作用浓度。免疫荧光显示Treg-CM处理的BMSC肌动蛋白纤维更密集且成束排列，但细胞迁移能力未发生显著改变。

Treg-CM在基因水平调控BMSC成骨分化

RT-qPCR结果显示，Treg-CM处理第4天显著上调早期成骨基因SP7（osterix）与TGFB1表达；第10天晚期标志物SPP1（osteopontin）表达显著高于对照组，BGLAP（osteocalcin）亦呈上升趋势。

Treg-CM促进BMSC基质沉积与矿化

ALP染色与酶活性检测表明，Treg-CM组第7天ALP活性显著增强；第10天ARS染色显示钙沉积量明显提升，证实Treg-CM加速了基质矿化进程。

Treg-CM蛋白质组谱显示免疫调节与细胞骨架调控富集

LC-MS/MS鉴定出Treg-CM中86个独特蛋白，包括细胞骨架调节蛋白（moesin、coronin-1A）、代谢相关酶（GAPDH、PKM）及mRNA结合蛋白。聚类分析揭示这些蛋白主要参与细胞质翻译、免疫应答及肌动蛋白细胞骨架组织等生物学过程。

Treg-CM与BMSC中特异性成骨细胞因子

细胞因子谱分析显示Treg-CM富含IL-10、IL-13、IFN-γ、VEGF、GM-CSF、MIP-1α等免疫调节因子。BMSC经Treg-CM处理后，培养上清中MIP-1α与G-CSF水平显著升高，提示二者可能协同介导成骨免疫微环境重塑。

本研究首次系统阐明了天然Treg分泌组通过多因子协同作用直接促进BMSC成骨分化的新机制。蛋白质组学与细胞因子谱联合分析揭示了Treg-CM中独特的蛋白组成与免疫调节网络，其中细胞骨架相关蛋白（如moesin、actin）可能通过重塑BMSC细胞力学特性启动成骨分化，而代谢酶（GAPDH、PKM）与mRNA结合蛋白则通过调控能量代谢与基因表达推动分化进程。尤为重要的是，BMSC在Treg-CM诱导下分泌MIP-1α与G-CSF等细胞因子，进一步强化了免疫细胞与骨祖细胞之间的正向反馈循环。该研究不仅深化了对骨免疫调控机制的理解，更为基于Treg分泌组的无细胞骨再生治疗策略提供了直接实验依据。后续研究可聚焦于关键蛋白的功能验证与体内动物模型疗效评估，推动其向临床转化应用。