利用大肠杆菌和荚膜红细菌两步发酵将粗甘油高效转化为清洁能源氢气的集成生物工艺

《Microbial Cell Factories》：Production of hydrogen from crude glycerol via an integrated process of L-malate biosynthesis by Escherichia coli and photofermentation by Rhodobacter capsulatus

本研究针对生物柴油副产物粗甘油高值化利用和清洁能源生产的双重需求，开发了一种集成暗发酵与光发酵的两步法工艺。研究人员通过代谢工程改造大肠杆菌强化甘油代谢途径，利用粗甘油高效合成L-苹果酸（最高产量11.5 g/L）；进而以发酵液为底物，利用荚膜红细菌进行光发酵产氢，最终实现58.0±6 mM的氢气产量。该研究为生物精炼产业链延伸提供了创新性解决方案，显著提升了生物柴油副产物的经济价值和环境效益。

　　

随着全球能源转型和碳中和目标的推进，生物精炼作为可持续发展的重要路径备受关注。生物柴油产业在快速发展的同时，也产生了大量副产物粗甘油，约占生物柴油产量的10%。这些粗甘油的传统处理方式不仅造成资源浪费，还带来环境压力。与此同时，清洁能源氢气作为化石燃料的理想替代品，其生物制备技术面临底物成本高的瓶颈。如何将粗甘油这一"废物"转化为高附加值产品，成为生物精炼领域亟待解决的关键问题。

传统的L-苹果酸生产工艺主要依赖葡萄糖为底物，且下游纯化过程复杂、成本高昂。虽然已有研究尝试利用微生物转化甘油生产L-苹果酸，但存在产量低、周期长等问题。特别是使用实际工业副产物粗甘油而非纯甘油的研究更为罕见。另一方面，光发酵细菌虽然能够利用有机酸产氢，但昂贵的纯基质成本限制了其规模化应用。因此，开发一种能够直接将粗甘油转化为氢气的集成工艺，具有重要的科学价值和实践意义。

发表在《Microbial Cell Factories》的这项研究创新性地提出了一种两步法集成工艺：首先通过代谢工程改造的大肠杆菌将粗甘油转化为L-苹果酸，然后利用荚膜红细菌将L-苹果酸进一步转化为氢气。这种"变废为宝"的策略不仅提高了生物柴油产业链的经济性，还为清洁能源生产提供了新思路。

研究人员采用了几项关键技术方法：通过代谢工程手段对大肠杆菌M4-ΔiclR/pck菌株进行改造，强化甘油激酶(GlpK)表达；利用微型生物反应器平台进行全因子实验设计，优化培养条件；建立通量平衡分析模型解析代谢通量分布；采用光生物反应器系统评估荚膜红细菌的产氢性能。研究使用的粗甘油样本来自阿本戈亚生物能源公司的生物柴油工厂。

菌株代谢工程改造增强L-苹果酸生产能力

研究团队以前期构建的M4-ΔiclR/pck大肠杆菌菌株为基础，通过过表达glpK基因进一步增强甘油代谢能力。实验结果表明，改造后的M4-ΔiclR/pck-glpK菌株L-苹果酸产量达到9.71±0.46 g/72 h，显著高于原始菌株的4.69 g/L。

甘油消耗速率从0.21 g/L·h提高至0.46 g/L·h，L-苹果酸摩尔得率达到0.58±0.05 mol/mol。这一改进证实了甘油摄取确实是生产过程的限速步骤。

培养条件优化提升工艺效率

通过全因子实验设计，研究人员系统评估了接种量、溶解氧和甘油浓度三个关键参数对L-苹果酸产量的影响。

研究发现初始生物量对产率有显著正向影响，而溶解氧在20%-100%范围内影响不显著。确定最佳条件为：初始OD₅₇₀ 1.1、溶解氧20%、甘油浓度19 g/L。

生物反应器放大验证工艺可行性

在0.5 L微型生物反应器中的放大实验表明，使用粗甘油的L-苹果酸产量达到9.55 g/24 h，高于纯甘油的8.89 g/48 h。

粗甘油展现出了更好的适用性，表明其除甘油外的其他成分可能对菌体生长和产物合成有促进作用。在19 g/L粗甘油浓度下，L-苹果酸产量进一步提升至11.41±2.88 g/24 h，摩尔得率达0.80±0.09 mol/mol。

代谢通量分析揭示机理变化

通量平衡分析结果显示，工程菌的代谢网络发生了显著重构：CO₂由净产出转变为净消耗（-3.13 mmol/g CDW·h），磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PPCK)通量增加，表明CO₂固定效率提高。ATP合成途径从氧化磷酸化转向底物水平磷酸化，能量代谢效率得到优化。

补料分批发酵验证工艺稳定性

补料分批发酵实验证明该工艺具有良好的可重复性。

第一批次L-苹果酸产量为10.07 g/20 h，第二批次虽初期产量较低（6.68 g/20 h），但最终达到11.09 g/40 h，展示了工艺的持续生产能力。

光发酵产氢实现能量转化

研究人员将暗发酵获得的L-苹果酸富集培养基用于荚膜红细菌的光发酵产氢。

结果表明，3 g/L L-苹果酸浓度下产氢效果最佳，氢气产量达58.0±6.0 mmol/92 h，产率为0.63 mmol/L·h。值得注意的是，荚膜红细菌不仅利用了L-苹果酸，还消耗了剩余的琥珀酸、乙酸和大部分甘油，总碳源利用率达87.1%。

本研究成功构建了一个高效、可持续的生物精炼平台，将生物柴油副产物粗甘油转化为清洁能源氢气。通过代谢工程和工艺优化的协同策略，实现了粗甘油到L-苹果酸的高效转化，并创新性地避免了传统下游纯化过程，直接利用发酵液进行光发酵产氢。这种集成工艺不仅降低了生产成本，还提高了资源利用效率，为生物精炼产业链的完善提供了技术支撑。研究结果展示了工业生物技术在促进循环经济和能源可持续发展方面的巨大潜力，为未来生物能源产业的发展提供了重要参考。