在自然环境中评估认知能力：脑容量与守巢雄性南瓜籽太阳鱼在新物体识别任务中的行为相关性

《Frontiers in Ethology》：Assessing cognitive performance in nature: brain size and personality correlates of novel object recognition in nest-guarding male pumpkinseed sunfish

本研究在自然条件下对繁殖期 pumpkinseed 鲈鱼雄性进行新物体识别（NOR）测试，发现相对脑质量与识别表现呈负相关，可能与繁殖期能量限制导致的学习能力抑制有关。

　　研究动物认知能力的影响因素在自然条件下具有挑战性，但在确保实验室测试结果能够反映野生种群的实际情况方面却是必要的。本研究利用南瓜籽太阳鱼（*Lepomis gibbosus*）父代雄性对巢穴的忠诚度，开展了一项新颖的物体识别（NOR）实验，旨在探索自然环境中动物认知能力的表现。通过在实验的不同阶段评估个体行为的一致性差异，并在实验结束后收集解剖学数据，包括脑部大小等信息，我们假设脑部大小可能影响南瓜籽太阳鱼的认知能力，并且在考虑个体行为差异后，能够预测NOR实验中的表现。

父代雄性南瓜籽太阳鱼在NOR实验的不同阶段对巢穴干扰和外围物体的反应表现出重复性，同时这些物体的探索行为也呈现出相关性。我们的研究发现了群体层面的新物体识别记忆的证据，尽管个体间存在显著差异。值得注意的是，个体在物体互动方面的差异并未影响NOR表现，但相对于身体长度的脑部质量却对NOR表现产生了影响。结果表明，相对于较小脑部的父代雄性南瓜籽太阳鱼表现更为优异，这似乎与父代雄性在繁殖期间面临的严重能量限制有关。具体而言，维持高能量成本的大脑可能使个体接近其能量极限，从而几乎没有剩余资源可用于学习过程中的认知需求。

认知能力通常被定义为个体处理、整合和使用环境信息的能力，并被认为在动物表现和适应性中起着关键作用。然而，影响认知测试表现的因素远不止于认知能力本身，包括个体行为的一致性差异、外部环境因素以及内部因素如繁殖状态、健康状况和压力水平。这些复杂因素可能交织在一起，使得认知测试结果难以准确解读。因此，为了更准确地估计认知能力及其在种群和物种间的变异，有必要考虑这些额外的影响因素。

长期以来，科学家对脑部大小与认知能力之间的关系表现出浓厚兴趣，不仅在脊椎动物中有所研究，在无脊椎动物中也存在类似探讨。一般认为，增加的脑部大小仅在存在足够认知挑战的情况下才会发生，因为神经组织的高能量成本可能会抑制不必要的脑部扩张。此外，神经活动效率的变化也可能影响认知能力，尤其是在脑部大小受到限制的情况下。然而，这种差异往往因测量难度较高而被忽视。

个体行为差异与脑部大小或认知能力无关的因素也可能影响认知测试的表现。动物性格和行为综合征是描述同一物种个体在不同时间和情境下稳定行为差异的概念。性格关注的是重复的行为差异，而行为综合征则强调个体内部不同行为特征之间的相关性。例如，个体在熟悉-胆怯连续体上的差异（即胆怯个体较少活动和探索，而胆大个体则更活跃和探索性强）可能与学习任务表现相关，因为探索行为的差异可能影响学习效率。例如，在非近交的CD-1小鼠中，探索倾向与学习表现呈正相关，无论其压力水平、情绪反应或身体特征如何。

因此，探索性格与认知之间的联系促使学者提出“认知综合征”的概念，即个体认知特征的组合可能形成不同的认知风格，从而影响个体获取、处理、存储和利用信息的方式，而与整体认知能力无关。许多研究已经表明，认知风格与学习表现之间存在关联。有趣的是，在同一物种中，研究显示，认知风格（如决策速度与准确性）与脑部形态相关，但并不影响空间记忆任务的表现。此外，人工选择脑部大小在同一种鱼中也影响了性格和学习任务表现，这种影响在不同性别中存在差异。

尽管在自然条件下研究认知能力具有挑战性，大多数认知测试仍然在受控的实验室环境中进行。然而，这种做法可能对结果产生干扰，因为人工饲养和驯化会显著改变动物的表型特征。例如，将野生鱼类转移到人工环境中可在2-6周内导致脑部大小的减少，这可能是由于表型可塑性造成的。此外，人工环境可能影响鱼类对自然猎物的觅食能力。鱼类性格差异在自然环境中相对稳定，但在实验室环境中似乎会消失。因此，自然环境和实验室条件的差异可能会影响认知测试结果，使其难以推广至自然种群。

本研究采用了一种自然环境下的认知测试方法，利用南瓜籽太阳鱼的生态型系统，该系统在湖岸（littoral）和湖中（pelagic）栖息地之间表现出脑部大小的差异，但没有形态学上的显著差异。该物种在自然种群中也表现出沿熟悉-胆怯连续体的行为差异。通过在繁殖季节对巢穴守卫的父代雄性进行NOR测试，我们能够评估不同测试阶段的稳定行为差异以及识别记忆的表现。在测试完成后，通过捕获个体并测量其脑部大小来获取解剖学数据。尽管我们没有直接证据表明脑部大小与NOR表现之间存在关联，但我们预计较大的脑部可能通过增强认知处理能力，从而提高在复杂任务中的表现。NOR任务被认为具有较高的认知需求，因为检测新奇性需要大量的记忆存储能力来区分环境中的新旧特征。此外，在同一种鱼的研究中，较大脑部可能提升复杂任务如逆转学习和数值辨别能力的表现，但对简单的颜色或空间辨别任务则没有显著影响。

本研究的关键问题包括：南瓜籽太阳鱼是否在自然环境中表现出NOR能力，以及NOR表现是否与脑部大小或性格特征相关。我们假设，脑部大小的变异（尤其是湖岸与湖中生态型之间的差异）会影响认知能力，并预测在控制个体行为差异后，较大的脑部将改善NOR表现。

为了评估行为一致性，我们采用了一种基于远程视频记录的方法，通过在巢穴周围放置低干扰的摄像头，同时记录巢穴和其守卫雄性的行为。NOR任务分为两个阶段：熟悉阶段和测试阶段。在熟悉阶段，一名浮潜者将两个相同的浮动物体放置在巢穴边缘，并记录30分钟内的行为。随后，这些物体被替换为一个新版本和一个新奇物体，再记录30分钟内的行为。雄性在安装新奇物体后通常会离开巢穴，但通常在潜水者离开后不到一分钟内返回，继续守卫繁殖。

在测试完成后，雄性被捕获、麻醉并保存以测量脑部大小。捕获时间因个体对网具的反应不同而有所变化，但通常不超过10分钟。为了减少捕获带来的压力，雄性在捕获后立即被转移至靠近的船只上进行麻醉处理，随后在0.1毫克/毫升的丁香油溶液中进行安乐死。这些方法得到了大学动物护理委员会的批准，并符合加拿大动物护理指南。研究的科学采样获得了安大略省自然资源部的许可。

视频记录通过JWatcher软件进行评分，评估雄性的行为。在2019年和2020年的研究中，由KM和MD分别评分，以评估评分者之间的重复性。我们只考虑与浮动物体相关的互动行为，包括接触、尾部接触和绕行等。为了增加行为的可变性，我们计算了两个物体互动的统计指标，分别是非接触互动（NCIO）和接触互动（CIO）。我们还记录了四种行为的持续时间：返回巢穴的延迟（LTR）、首次物体互动的延迟（LTI）、物体互动的总时间（TTI）以及巢穴两侧的时间分布。LTR可能反映个体对干扰的反应，而LTI可能反映对物体的好奇或恐惧，TTI则可能反映探索意愿。尽管非接触和接触互动的频率在个体间差异不大，但通过计算这些指标，我们能够更好地理解个体行为的多样性。

为了评估评分者之间的重复性，我们使用了内相关系数（ICC），通过分析15个巢穴行为的子样本进行计算。结果显示，鱼类在两侧时间分布、物体绕行和总互动时间等方面表现出较高的重复性，而在尾部接触方面重复性较低，表明评分者误差较大。

在评估NOR表现时，我们使用了两种变量：非接触互动的总次数（NCIO）和两侧时间分布。由于只有28%的个体表现出接触行为，因此我们未使用接触互动作为NOR表现的指标。我们计算了这两种变量在熟悉和测试阶段的识别比值（DR），并比较了两阶段的差异（ΔDR），以量化NOR表现，同时控制个体对物体的偏好或回避。我们的主要兴趣在于整体记忆和区分能力，而非偏好或回避本身。因此，我们分析了ΔDR的绝对值，以有效评估个体的NOR表现。

脑部质量被用来估计脑部大小。对于保存时间少于7个月的雄性，我们通过解剖获得脑部质量，并使用Accu-124D电子秤测量，精度达到0.0001克。我们还测量了标准长度（±1毫米），以控制和探讨身体大小对表现的影响。体况指数（SMI）也被用来评估体况。年份、栖息地和标准长度对原始脑部质量均产生了显著影响，因此我们通过对数转换后的脑部质量与标准长度和年份因子进行回归分析，以获得相对脑部质量（YrSz-adj. BM）。

在评估NOR表现时，我们首先使用单样本t检验分析ΔDR的绝对值，以确定整体群体是否表现出显著的识别能力。结果显示，群体层面确实存在识别记忆的证据，尽管个体间存在显著差异。此外，NCIO的识别比值在群体层面也表现出显著差异。为了进一步分析预测因素，我们使用一般线性模型，包括固定因子如栖息地、年份、行为差异（CF1和CF2）、脑部质量及其与行为因素的交互作用。我们发现，相对脑部质量与NCIO |ΔDR|之间存在显著的负相关，而与时间分布的识别比值则无显著关系。这表明，脑部质量可能对非接触互动的表现产生影响，但对时间分布的表现影响不大。

我们的研究结果挑战了传统认知能力与脑部大小之间的正相关假设。这可能与父代雄性在繁殖期间面临严重的能量限制有关。由于繁殖期间停止主动觅食，父代雄性可能因持续的巢穴防御和幼鱼照顾而损失6%-15%的体重，且繁殖后死亡率增加。较大的脑部可能意味着更高的能量成本，使得个体更接近其能量预算的极限，从而难以投入资源进行学习过程。此外，学习过程本身可能具有较高的能量需求，如增加的脑部能量消耗、学习后的压力反应以及在食物短缺时对记忆的抑制。因此，我们假设，较大的脑部可能在繁殖期间因能量限制而影响学习表现，而较小的脑部则可能因较低的能量维护成本而具备足够的资源进行学习。

在自然环境中进行认知研究时，可能会遇到一些混淆因素，例如未知的环境变量可能与已知因素相关。然而，通过设计实验以保持生态现实性，我们能够减少这种混淆。湖岸生态型的脑部大小通常大于湖中生态型，这可能是我们研究的主要目标。尽管在NOR表现分析中结合了湖岸和湖中个体以最大化脑部大小的变异，但我们排除了栖息地对NOR表现的混淆效应。因为NOR得分通过计算熟悉和测试阶段的互动行为差异，可以去除个体间互动差异的影响。此外，将栖息地作为变量纳入最终模型后，发现其对NOR表现的影响并未改变相对脑部质量与NOR表现之间的负相关关系。

本研究还揭示了父代雄性南瓜籽太阳鱼的性格差异。通过探索性因素分析（CFA），我们发现了两个共同因素（CF1和CF2），它们能够解释行为变异的显著部分。CF1代表了主动探索性格，而CF2则代表了巢穴警觉性格。CF1较高的个体在返回巢穴后更积极地探索新奇物体，表现出较低的首次互动延迟和较长的互动时间。CF2较高的个体则表现出更快的返回延迟和更高的互动频率，这可能与更高的巢穴警觉性有关。这些性格特征可能受到内在和外在因素的调节，如体型大小和环境风险。

然而，个体性格差异在繁殖成功中的影响仍需进一步研究。尽管一些研究表明性格差异可能影响繁殖成功率，但在父代雄性南瓜籽太阳鱼中，这种影响尚未明确。例如，在其他太阳鱼种类中，性格差异与捕食风险、饮食和寄生虫负荷相关。然而，在父代雄性中，性格差异对繁殖成功率的影响仍不清楚。

本研究的结论表明，南瓜籽太阳鱼在自然环境中表现出新奇物体识别能力，这表明认知能力可以在野外进行测量。然而，与实验室实验的预期相反，我们发现较大的脑部可能不利于学习表现。这可能反映了繁殖期间雄性面临严重的能量限制。由于繁殖期间停止觅食，较大的脑部可能使个体更接近其能量极限，从而难以投入资源进行认知学习。这一发现强调了在自然条件下进行认知测试的重要性，以及能量可用性和消耗率对认知表现的影响。未来的研究需要进一步探讨这些因素如何相互作用，以更全面地理解动物性格、脑部大小和认知表现之间的关系。