石生物群落的异质性及地理距离塑造了巴西山区系统内的景观基因组学特征

《Ecology and Evolution》：Lithobiomes Heterogeneity and Geographic Distance Shape the Landscape Genomics Within Brazilian Mountain Systems

地质多样性、气候梯度与地理距离对巴西山区植物遗传结构的影响分析。通过全基因组SNP分析，发现铁质岩和石英岩生境（campos rupestres）的种群遗传分化显著高于火山岩和片麻岩生境（campos de altitude），主要受地面生物物理特征（如温度、植被指数）和空间隔离驱动，气候因素贡献度较低。鉴定出36个可能受自然选择调控的SNP位点，揭示岩石生境特异性过程对遗传多样性的关键作用。

　　本研究探讨了巴西东南部山区植物物种的遗传结构，特别是在不同的岩石生态系统中。通过分析广泛分布的单核苷酸多态性（SNP）数据以及多种土壤气候数据集，我们识别了两种主要的遗传集群，分别对应于已知的岩石生态系统。此外，进一步的亚结构反映了岩石生态系统中土壤成分的多样性。基因组变异主要由地理距离主导，其次是地面生物物理预测因子，而大气层的气候因素对遗传变异的影响较小。我们还鉴定了36个可能与选择性基因相关的SNP，这些SNP主要与空间和生物物理预测因子相关。研究结果表明，生态地理隔离和种群对环境异质性的适应在驱动碎片化山区中的遗传分化方面起着重要作用。这些模式强调了岩石生态系统特有的过程在塑造生物多样性中的重要性，并为这些生态系统的进化动态提供了新的见解。

巴西东南部的山区以其复杂的环境特征、多样化的地质和地貌形成而著称，这使得它们成为研究岩石生态系统中植物种群遗传结构的理想系统。高海拔地区的开阔草原，如“campos de altitude”和“campos rupestres”，代表了该地区最显著和多样的岩石出露。这些生态系统具有特定的土壤气候条件，包括高紫外线辐射、浅层土壤和气候波动。与传统的生物群落分类不同，这些区域更常被定义为“岩石生物群”（lithobiomes），其中岩石成分对局部生态过程的影响超过了气候变量。因此，理解这些岩石生物群的生态地理隔离和种群间的适应性差异，对于揭示这些生态系统中的遗传分化机制至关重要。

在“campos rupestres”中，存在三种不同的岩石生物群，包括与砂岩、石英岩和铁矿石相关的“cangas”，这些岩石生物群分布在海拔900米以上。相比之下，“campos de altitude”主要位于大西洋森林生物群的范围内，特别是Serra do Mar和Serra da Mantiqueira地区。这些地区以寒冷潮湿的气候为特征，并且拥有高度特化的植被，通常与安第斯山脉的帕拉莫（Páramos）相似。在这些岩石生物群中，大约70%的植物物种仅限于单一的岩石生物群，而不到8%的物种分布在三个不同的岩石生物群中。已有证据表明，跨岩石生物群的物种谱系可能表现出相似的多样化模式，但这些岩石生态系统中遗传连通性的程度仍需进一步探索。研究这些物种的遗传结构对于理解基因流动模式以及它们对不同土壤条件的局部适应具有重要意义。此外，明确这些岩石生态系统中种群是否在长时间内保持遗传隔离，或者经历间歇性的基因流动，可以为它们在环境变化下的生存能力和适应能力提供有价值的见解。

“Paepalanthus calvus”是一种罕见的物种，仅限于“campos de altitude”以及石英岩和铁矿石相关的“campos rupestres”。这使得它成为研究不同岩石生物群中种群遗传结构的理想模型。本研究旨在探讨地理距离、岩石类型和生物物理特征如何影响该物种的基因组景观。具体来说，我们提出了两个关键问题：该物种的种群是否在遗传上存在差异，并按照岩石生物群类型进行聚类？以及，该物种的基因组变异主要由哪些预测因子驱动：岩石类型、地理距离、气候因素，还是地面的生物物理特征？

在研究系统中，我们采集了巴西东南部Mantiqueira和Quadrilátero Ferrífero地区的九个地点的样本，涵盖了该物种的整个地理分布范围。从这些地点中，我们采集了来自“campos de altitude”的五个种群中的八个个体，以及来自石英岩“campos rupestres”的三个种群和来自铁矿石“campos rupestres”的一个种群。为了防止重复采样，我们仅从每个种群中不同植株群落中采集叶片样本。在大型种群中，个体之间至少保持15米的距离采样；在小型种群中，个体分布范围不超过20米时，保持至少1米的距离。所有标本均保存在RB标本馆中。

为了确定每个种群的岩石类型，我们使用了“sf” R包中的“st_intersects”函数，将个体坐标与地质层数据进行交叉分析。基于采集的数据，我们参照Benites等（2003）和Machado与Silva（2010）的方法，对岩石类型进行了分类。在“campos de altitude”中，种群被归类为火山岩形成的花岗岩/片麻岩地质群（GG），其中包括在花岗岩（EX）或片麻岩（PM、CJ、DF、ITM）基质上生长的种群。在“campos rupestres”中，石英岩形成的种群进一步分为两个组：石英岩组（QT），包括以石英岩为主导的基质（MD和IBI），以及云母/石英岩组（PQT），其中云母是主要基质，石英岩为次要成分（SC）。最后，来自铁矿石“campos rupestres”的种群代表了云母/大理岩组（ID），其基质成分包括云母和大理岩（SPD；见表1）。

我们整理了两个环境变量数据集，采用了Ramos（2023）的方法。大气层数据来源于WorldClim（WC）的19个生物气候数据库，空间分辨率为1公里，涵盖1970年至2000年的数据（Fick和Hijmans，2017）。地面数据则来自NASA的中分辨率成像光谱辐射计（MODIS）数据库，分辨率为250至1000米（Hengl等，2014），涵盖2021年7月至2023年6月的近期数据。考虑到该物种的繁殖季节（Cabrini等，2025），MODIS变量仅限于雨季，即11月至4月。数据提取和处理使用了R中的“rgee”包（Aybar等，2020），该包能够通过Google Earth Engine进行地理空间处理。此外，我们还加入了全球数字高程模型（GDEM）的海拔数据库（ASTER 30米；NASA等，2019）。所有栅格数据均被缩放至250米分辨率，并基于物种发生数据的地理范围进行处理。从处理后的栅格中，我们提取了对应每个发生点的环境变量，并将其用于后续分析。

为了评估多重共线性以及变量在每个数据集中的贡献，我们使用了“ade4”包中的“dudi.pca”函数进行了主成分分析（PCA）。根据最高特征值，我们保留了主成分，以解释至少70%的总方差（表S2和S3；Kaiser，1961）。使用“factoextra”包中的“fviz_contrib”和“fviz_pca_var”函数，我们评估了每个变量对主成分的贡献（见图S2A–F；Kassambara和Mundt，2020）。最终的数据集包含16个变量，包括来自WC的9个变量（bio01、bio02、bio06、bio09、bio12、bio13、bio15、bio16、bio17）和来自MODIS的7个变量（地表温度、总蒸散发、增强植被指数、光合有效辐射的分数、初级生产力、地表反射率波段1和波段2，以及净光合）。

我们采用MIG-seq方法从硅胶干燥的叶片组织中提取基因组DNA，使用Nucleo Spin Plant II试剂盒（Macherey-Nagel，德国）并进行轻微修改。我们通过1%琼脂糖凝胶验证DNA完整性，并使用Nanodrop 2000（Thermo Fisher Scientific，美国）对其进行定量。为了获得全基因组的单核苷酸多态性（SNPs），我们采用了Suyama和Matsuki（2015）描述的多重ISSR基因分型测序方法，并按照Suyama等（2022）的方法进行文库制备。测序在Illumina MiSeq平台上进行，使用MiSeq试剂盒v3（150周期；Illumina）。

在合并每个样本的正向和反向读取后，我们使用Trimmomatic v.0.32（Bolger等，2014）并采用以下命令：HEADCROP:6、CROP:77、SLIDINGWINDOW:10:30、MINLEN:51，去除低质量读取。过滤后的读取使用Stacks v.2.41管道（Rochette等，2019）进行组装。最小深度设置为6（?m 6），其他选项使用默认值。使用Stacks中的“populations”程序，我们提取了缺失率低于50%的SNPs，并为了消除假基因和可能的PCR错误，去除了观察杂合度高于0.6的位点和等位基因计数低于0.3的SNPs。此外，我们使用PLINK v1.90（Chang等，2015）去除了高度连锁的SNPs，其R2值大于0.4。最终，从71个个体中获得了2243个SNPs，经过严格的质控措施后，最终获得1734个缺失率低于50%的SNPs。最后，使用VCFtools和PGDSpider2生成用于后续遗传分析的输入文件（Danecek等，2011；Lischer和Excoffier，2012）。

为了估计预期（H_E）和观察（H_O）的杂合度，我们使用了“adegenet”包（Jombart等，2018）。我们使用“bartlett.test”函数评估了不同种群间杂合度方差的显著性差异。为了确保数据正态性，我们按照Masuda等（2022）的方法对杂合度值进行了反正弦变换。核苷酸多样性（π）使用DnaSP v.6（Rozas等，2017）进行计算。种群间的近亲繁殖（F_IS）和总体遗传分化（F_ST）系数使用“hierfstat” R包中的“basic.stats”函数进行计算。该函数采用Nei（1987）的方法估计F统计量。

为了调查祖先混合和种群间的遗传聚类，我们使用了STRUCTURE v.2.3.4软件（Pritchard等，2000）进行了贝叶斯分析。我们应用了一个独立等位基因频率的混合模型，测试了K值从1到10的情况。对于每个K值，进行了500,000次马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）迭代，并采用50%的烧入期以确保参数稳定性。通过Evanno的ΔK方法和Pritchard等（2000）在CLUMPAK（Kopelman等，2015）中确定的K值，我们确定了最佳的聚类数量。此外，我们还使用“ade4”包中的“dudi.pca”函数对1734个SNPs进行了PCA分析，使用前两个主成分进行可视化，使用“factoextra”包中的“fviz_pca_var”函数（Kassambara和Mundt，2020）。

我们通过最大似然法构建了系统发育树，使用RAxML v.8.2.12（Stamatakis，2014）进行分析。我们包括了“Paepalanthus salimenae”（Cabrini & Trovó）的两个种群（各八个个体）作为外群，使用了之前在Cabrini等（2024）中发表的数据集。指定GRTGAMMA+I模型作为核苷酸替换模型，并采用1000次靴带测试（bootstrap）以评估类群的支持度。分析在CIPRES Science Gateway门户（Miller等，2011）上进行，系统发育树在FigTree v.1.3.1（Rambaut，2009）中进行可视化。

为了进一步评估种群间的遗传分化和层级结构，我们使用GenAlex v.6.5（Peakall和Smouse，2012）进行了分子方差分析（AMOVA），以评估种群内部、种群之间和区域之间的遗传变异分布。区域被分为两个层级：“campos de altitude”和“campos rupestres”。我们还通过“dartR”包中的“gl.fst.pop”函数（Gruber等，2018）计算了配对基因流（N_m）和遗传分化系数（F_ST），并进行了100,000次置换。

为了评估基因组变异及其与岩石类型、环境变量和地理距离的关系，我们进行了隔离距离和隔离环境分析。种群间的地理距离基于纬度和经度计算为欧几里得距离，而Nei的遗传距离使用GenAlex v.6.5进行估计。我们使用“vegan”包中的“mantel”函数进行了地理距离和遗传距离之间的相关性分析，共进行了10,000次置换。为了评估环境变量与遗传距离之间的相关性，我们进行了PCA，以获得WC、MODIS和海拔变量的前两个主成分。这些主成分值被用作二维点，计算配对距离矩阵（Pluess等，2016）。由主成分点生成的距离矩阵与遗传距离通过皮尔逊相关系数进行相关性分析，使用“stats”包中的“cor”函数进行计算。

我们使用“vegan”包进行了冗余分析（RDA），以评估基因组变异与地理、环境和岩石类型的关联，遵循Forester等（2018）的方法。在分析之前，我们通过皮尔逊测试（图S3）评估了环境相关变量的多重共线性，并排除了高度相关的变量。此外，我们进行了Kruskal-Wallis测试（kruskal.test），以检验非共线性环境变量在生态系统间的显著差异。空间自相关通过距离基于Moran's特征向量图（dbMEMs）建模，使用“adespatial”包（Dray等，2006）实现。我们仅保留了正的特征向量以表示大尺度空间模式。dbMEMs的全局显著性通过RDA分析，使用999次置换进行评估，通过调整后的R2（R2_adj）进行正向选择，以确定显著的dbMEMs（见表S3；Blanchet等，2008）。

我们首先拟合了一个包含所有候选解释变量的全局RDA模型：三个MEMs（MEM1、MEM2和MEM3）、三个通过皮尔逊测试和相关直方图识别的非共线性环境变量（EVI、DT和VS），以及岩石类型组。随后，我们应用了基于R2_adj的逐步选择方法，以确定最终的预测因子集合。使用“vegan”包中的“anova.cca”函数，我们通过999次置换进行了ANOVA测试，以评估每个轴、所有变量和单个变量在最终RDA中解释的方差显著性。此外，我们还使用了“vegan”包中的“varpart”函数进行了解释矩阵的变异分割分析。

我们通过RDA排序空间中的SNP载荷，识别了与环境和空间预测因子相关的候选SNPs，采用Forester等（2018）的方法。SNP载荷提取自三个显著的约束轴，候选位点基于极端值确定，使用三倍标准差阈值以捕捉可能处于选择下的位点（双尾p值=0.0005）。候选SNPs与六个预测因子（MEM1、MEM2、MEM3、EVI、DT和VS）之间的相关性被计算，并为每个SNP确定了与预测因子相关性最高的变量。为了缓解多重共线性，我们去除了在多个轴上检测到的SNPs。所有分析均使用“vegan”包在R中进行。

研究结果表明，地理距离和环境因素在该物种的基因组变异中起着关键作用。通过隔离距离分析，我们发现遗传距离与地理距离之间存在显著的正相关（r=0.7053，p<0.001；图S6A）。在隔离环境分析中，WC的前两个主成分解释了71.92%和22.56%的方差（图S7A）。然而，皮尔逊相关性测试并未发现九个WC变量与遗传距离之间存在显著关联（r=0.1563，p=0.1896），因此这些变量未被纳入RDA模型中。

对于MODIS变量，前两个主成分解释了69.03%和23.84%的方差，分别对应于七个选定的变量（图S7B）。皮尔逊相关性测试显示，遗传距离与MODIS变量之间存在显著关系（r=0.2698，p=0.0218；图S6B）。为了确保纳入最具信息量的预测因子并避免模型的高估，我们排除了高度相关的变量，最终选择了日地表温度（DT）、地表反射率（VS）和增强植被指数（EVI）作为RDA模型的预测因子。

冗余分析确认了基因型与环境之间的关联，空间和环境预测因子在遗传变异中发挥了重要作用（方差=23,505，F=12.383，p=0.001）。逐步选择模型确定了最具解释力的变量：MEM2、DT、MEM3、VS、EVI和MEM1，分别对应于调整后的R2（R2_adj=0.4974；表3）。然而，由于与环境变量的多重共线性，岩石类型组未被保留。变异分割分析显示，环境和空间预测因子共同解释了遗传变异（表S6）。环境变量单独解释的变异比例为0.204，而选定的空间预测因子单独解释的变异比例为0.251。环境与空间预测因子之间的共享变异比例为0.043，剩余变异比例为0.503，占总变异的大部分。

此外，我们的发现表明，铁矿石和石英岩“campos rupestres”之间存在明显的分化模式，这与之前的研究一致，这些研究区分了这些岩石生物群（Mucina，2018；Massante等，2023；Azevedo等，2024）。观察到的遗传结构支持了这两个不同的岩石类型组（QT和ID），每个组具有不同的遗传组成。我们的数据还对石英岩“campos rupestres”进行了更细致的分析，识别出两个不同的岩石类型组（QT和PQT），它们具有不同的遗传组成。SC种群（PQT组）在Quadrilátero Ferrífero地区与Mantiqueira山脉中的其他石英岩种群分离，这引发了关于特定环境因素如何塑造遗传结构和种群分布的进一步问题。这种模式可以通过岩石对土壤形成和植物生存条件的影响来理解，正如Kruckeberg（2004）所强调的那样。

岩石生物群通过地质过程影响景观形成，这些过程定义了特定的土壤类型，进而塑造了驱动植被选择的土壤气候条件，最终促进局部多样化（Kruckeberg，2004；Rahbek等，2019）。尽管岩石类型组因与环境变量的多重共线性未被纳入最终的RDA模型，但环境预测因子间接反映了它们的影响，体现了不同岩石类型相关的土壤条件和微气候变化。MODIS变量日地表温度（DT）、地表反射率（VS）和增强植被指数（EVI）捕捉了这些岩石异质性的细尺度生态后果，这对于解释植物物种的基因组景观至关重要。相比之下，来自WorldClim的广泛气候变量未显示出与遗传距离的显著相关性，这可能是因为土壤条件和地形的强烈影响，以及岩石生物群内部的高气候异质性，这些因素可能比区域气候趋势对种群结构的影响更大（Fischer等，2013；Hulshof和Spasojevic，2020；Booker，2024）。

岩石生物群以其环境多样性为特征，岩石基质、日照暴露和土壤类型（Azevedo等，2024）存在差异，这些差异可能直接影响植物分布和对这些条件适应的基因型选择（Macel等，2007）。这在我们的环境数据中得到了体现，显示出不同岩石生物群中显著的热梯度。石英岩和铁矿石“campos rupestres”表现出较高的DT值，这是由于植被覆盖较少，如增强植被指数（EVI）值较低所导致的。较低的植被覆盖不仅增加了基质的暴露，还放大了岩石出露的典型极端条件，如高紫外线辐射、快速水分流失和地表温度的变化，这些温度可以达到45°C（Jacobi和Do Carmo，2008；Schaefer等，2016）。

这些具有挑战性的环境条件可能对植物种群产生选择压力，促进沿纬度和微环境梯度的适应性分化，并常常导致遗传变异（Juri和Premoli，2021；Barros等，2018；Lin等，2021；Li等，2023；Sekely等，2024）。在我们的研究物种中，这些选择压力体现在功能特征上，如在较温暖、暴露的“campos rupestres”中，个体发展出较大的叶片或储水的莲座状结构，这在采集的标本中得到了观察（表1—标本馆标本）。相比之下，“campos de altitude”表现出较低的DT值和较高的EVI值，反映了更密集的植被覆盖。这些高海拔草原位于大西洋森林生物群的最高和最寒冷地区，被密集的森林基质包围，这降低了VS值，缓和了热极端，并有助于形成较凉爽的微气候（Safford，1999a，1999b；Kessous和Freitas，2023）。尽管这些大范围的模式明显，但某些种群层面的对比（如ITM种群的VS值和MD种群的DT值更接近“campos de altitude”生态系统）反映了微环境的细微差异。这些微妙的差异表明，除了主要的岩石生物群差异外，局部环境变化可能在塑造种群结构中也起着重要作用。

最后，我们的研究结果对保护工作具有重要意义，因为它们表明不同种群适应了特定的土壤限制和微气候条件。种群间的隔离及其局部适应可能限制该物种对未来环境变化的响应能力，特别是在气候变化和栖息地破碎化的压力下。因此，保护策略应优先考虑每个岩石生物群内的种群，确保遗传变异的维持，特别是在ID和GG区域，这些区域是重要的采矿区。