两种定制探针试剂盒在溶液中富集古代鸟类DNA方面的性能比较

《Molecular Ecology Resources》：Performance of Two Custom Probe Kits for In-Solution Enrichment of Ancient Avian DNA

古DNA分析中，比较RNA探针（myBaits）和DNA探针（Twist）在乌鸦骨骼样本捕获效率。结果显示myBaits捕获效率显著更高，尤其在GC中等到中等区域，而Twist在GC>50%区域表现更优。两者均有效提升测序深度，降低成本，myBaits在多数样本中目标效率达68.2%，Twist仅9.6%-20.2%。基因分型准确性相近，但Twist在低质量样本中略优。RNA探针形成更稳定杂交，DNA探针对GC丰富区域更适应。

　　在古代DNA（aDNA）研究领域，由于样本中内源性DNA含量较低，分析过程始终面临诸多挑战。尽管近年来测序技术取得了显著进展，特别是下一代测序（NGS）技术的广泛应用，使得DNA的快速、高通量分析成为可能，但aDNA的复杂性和降解特性仍限制了其分析的深度和效率。为了解决这一问题，一种名为“溶液中杂交捕获”的技术被广泛采用，通过设计特定的探针，靶向捕获感兴趣的基因组区域，从而提高内源性DNA的回收率，同时减少整体测序工作量。然而，不同商业探针系统在捕获效率上的表现尚未得到充分理解，尤其是在非模式生物中。

本研究聚焦于两种常见的商业探针系统：基于RNA的myBaits和基于DNA的Twist。通过使用23块来自波兰和保加利亚的冠群鸦（*Corvus corone*）骨骼样本，这些样本的年代跨度从100年到14,000年前，我们评估了这两种探针系统在富集内源性aDNA方面的性能。目标区域包括104,000个全基因组单核苷酸多态性（SNPs），这些SNPs来源于现代冠群鸦种群。实验结果表明，myBaits在多个关键指标上均优于Twist，如靶向捕获率和靶向效率，同时在某些极端GC含量区域表现出一定的局限性。Twist虽然在高GC区域的覆盖能力更强，但其捕获效率较低，主要由于其捕获的内源性DNA多来自非靶向区域。这些发现为选择合适的商业探针系统提供了参考，帮助研究者在设计aDNA研究时做出更优的决策。

本研究首先回顾了aDNA分析的技术背景和发展历程。随着NGS技术的普及，aDNA分析逐渐成为古生物学和遗传学研究的重要手段。然而，由于aDNA的降解特性，其有效分析需要进行深度测序，这在成本和时间上均具有挑战性。为此，溶液中杂交捕获技术应运而生，该技术通过使用特定的探针，能够有效富集感兴趣的基因组区域，提高内源性DNA的覆盖度，同时降低整体测序负担。最初，这类技术主要依赖于实验室自制的探针，但近年来，商业化探针系统的出现使得这一技术更加普及，广泛应用于包括鸟类、植物、哺乳动物、病毒和细菌等不同生物的aDNA研究。

接下来，我们探讨了两种商业探针系统的设计差异。myBaits系统使用单链RNA（ssRNA）探针，每个SNP对应四个60 bp的探针，分别覆盖SNP的上下游区域以及两个可能的等位基因。相比之下，Twist系统使用双链DNA（dsDNA）探针，每个SNP仅对应一个80 bp的探针。尽管这两种系统均采用了类似的技术原理，但在探针类型和覆盖策略上存在显著差异。这些差异可能会影响它们在不同基因组区域的捕获效率，特别是在GC含量较高的区域。此外，两种系统的操作流程和试剂使用也有所不同，这可能进一步影响其性能表现。

在实验方法部分，我们详细描述了样本的采集、处理和测序流程。所有样本均来自波兰和保加利亚，样本量为23块骨骼。为了减少外源性污染，我们在实验过程中采用了严格的无菌操作，包括在无菌室中进行DNA提取，并对骨粉进行预处理。随后，我们利用自动化设备制备了单链DNA（ssDNA）文库，并通过PCR对其进行了扩增和索引标记，以便进行多路复用测序。在完成文库制备后，我们进行了浅层的霰弹测序，以评估每种文库的内源性DNA含量。基于此，我们对四种样本进行了深度测序，以比较不同探针系统对aDNA的捕获效果。

为了评估两种探针系统的性能，我们使用了两种关键指标：靶向率和靶向效率。靶向率是指靶向区域的读数占所有原始读数的比例，而靶向效率则衡量靶向区域的读数占整个基因组读数的比例。通过这两种指标，我们能够更全面地了解不同探针系统在捕获目标区域方面的表现。实验结果显示，myBaits在所有样本中均表现出更高的靶向率和靶向效率，尤其是在样本质量较差的情况下，其富集效果更为显著。相比之下，Twist虽然能够保留更多的内源性DNA，但大部分属于非靶向区域，导致其靶向效率较低。此外，Twist在高GC含量区域的覆盖能力更强，这可能是其在某些特定研究中的优势所在。

为了进一步评估靶向覆盖的均匀性，我们计算了每种样本在不同GC含量区域的覆盖情况。结果表明，myBaits和Twist在低GC含量区域的覆盖表现较为相似，但在高GC含量区域，Twist的覆盖能力显著优于myBaits。这说明Twist在处理GC含量较高的基因组区域时可能更具优势。然而，在整体的靶向效率方面，myBaits仍然优于Twist，尤其是在样本质量较差的情况下，其能够更有效地捕获目标区域。此外，我们还分析了捕获读数的长度以及DNA损伤模式，发现myBaits在捕获受损的古代DNA片段方面表现更为出色，这可能与其RNA探针的稳定性有关。

在基因型检测和等位基因偏差方面，我们比较了两种探针系统与霰弹测序在目标SNP位点的检测效果。结果表明，myBaits和Twist均能够显著提高SNP检测的成功率，尤其是在样本质量较低的情况下。然而，两种系统在基因型准确性上存在细微差异，其中Twist在更严重的DNA降解样本中表现稍好，这可能与其探针设计或文库处理方式有关。此外，我们发现两种系统在等位基因深度比例上均与霰弹测序结果相似，表明它们在靶向区域的捕获过程中并未表现出显著的等位基因偏差。然而，在转换变异（transition variants）中，C→T和G→A的替代率较高，这可能与古代DNA的损伤模式有关，而非探针系统本身的选择偏差。

在讨论部分，我们深入分析了两种探针系统在不同基因组区域的表现差异。尽管myBaits在靶向效率方面具有优势，但Twist在处理高GC含量区域时表现更为稳定，这可能使其在某些特定的研究中更具适用性。然而，myBaits的高靶向效率和覆盖能力表明其在大多数情况下是更优的选择。此外，我们还探讨了实验设计中的潜在限制因素，例如探针数量和输入DNA量对覆盖效果的影响。虽然Twist的探针数量较多，但myBaits仍能通过更高的靶向效率和更广的覆盖范围，在多数情况下取得更好的效果。

最后，我们总结了本研究的主要发现和意义。尽管Twist在某些特定条件下表现良好，例如高GC含量区域，但myBaits在整体靶向效率和覆盖能力上均优于Twist。这表明，在大多数aDNA研究中，选择基于RNA的探针系统可能更有利于提高研究效率和数据质量。然而，随着技术的不断发展，未来的研究可能会进一步优化这两种探针系统，以提高其在不同基因组区域和不同样本质量下的表现。此外，实验中使用的样本数量和质量限制了研究的全面性，未来需要更多的样本和更精细的分析方法，以进一步揭示不同探针系统在aDNA研究中的性能差异。