一种集成HCR和CRISPR-Cas12a技术的双信号放大生物传感器，用于精准量化FEN1的活性

《Microchemical Journal》：Dual-signal amplification biosensor integrating HCR and CRISPR-Cas12a for precision quantification of FEN1 activity

FEN1检测方法融合HCR与CRISPR-Cas12a trans-cleavage，实现超灵敏（LOD 1.6×10?3 U/mL）线性检测（2×10?3-5.0 U/mL），简化操作流程，支持癌细胞与正常细胞样本区分及抑制剂筛选。

　　这项研究介绍了一种新型的双级放大生物传感器，该传感器结合了杂交链反应（HCR）与CRISPR-Cas12a的转切割功能，用于对FEN1进行超高灵敏度的检测。FEN1是一种关键的基因组不稳定性标志物，与癌症的发展密切相关。因此，开发一种高效、准确、简便的FEN1检测方法对于临床诊断和药物研发具有重要意义。

传统的FEN1检测方法，如免疫化学分析、Western blot和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），虽然在一定程度上能够提供FEN1的检测信息，但它们大多局限于定性或半定量分析，并且在操作流程上存在一定的复杂性。此外，这些方法通常依赖于特定的实验条件和设备，难以在实际应用中实现快速、高效的检测。近年来，研究人员尝试利用纳米材料构建更灵敏的FEN1检测系统，例如基于石墨烯氧化物（GO）的纳米生物传感器或结合DNA修饰金纳米颗粒与有机染料的检测方法。然而，这些方法仍然需要人工合成的纳米材料，不仅增加了操作时间，也带来了更多的实验步骤。同时，由于它们只能产生单一信号响应，因此在灵敏度方面存在一定的局限。

为了克服这些挑战，研究人员开始探索无需酶参与的DNA放大技术，如催化发夹组装（CHA）和HCR。这些技术能够实现信号的自我复制，从而提高检测的灵敏度和准确性。例如，Ye等人利用CHA和HCR技术，将miRNA和三聚氰胺等目标分子转化为含有PAM序列的DNA双链，从而激活Cas12a进行后续的信号放大。这一策略不仅简化了实验流程，还增强了检测的稳定性与可重复性。

本研究设计的双级放大生物传感器（DHC）通过HCR和CRISPR-Cas12a的协同作用，实现了对FEN1的高灵敏度检测。其检测机制分为三个阶段：首先，FEN1通过其结构特异性酶活性对商业化的磁珠结合三域探针（MB-TDP）中的5′- flap/dsDNA连接处进行切割，释放出5′- flap片段；其次，释放出的5′- flap片段作为启动子，触发HCR反应，生成包含PAM序列的双链DNA扩增产物；最后，CRISPR-Cas12a复合物通过crRNA引导识别这些PAM序列，激活转切割功能，切断荧光报告分子，从而产生可检测的荧光信号。这种设计不仅提高了检测的灵敏度，还增强了系统的特异性，使其能够准确区分不同细胞样本中的FEN1水平。

在实验验证方面，研究人员通过电泳分析确认了三链DNA探针（TDP）的正确组装。随着不同寡核苷酸的逐步加入，电泳迁移率逐渐减缓，表明形成了更高分子量的DNA结构。这一结果证实了TDP的组装过程是通过T-strand、3′- flap DNA和5′- flap DNA的连续杂交实现的。随后，TDP被固定在磁珠表面，形成了MB-TDP。这种设计不仅提高了探针的稳定性，还便于后续的实验操作。

在实际应用中，DHC系统能够有效检测肿瘤细胞裂解液中的FEN1，并且可用于筛选FEN1抑制剂药物。该系统在检测过程中不需要额外的酶处理，避免了多酶依赖性带来的操作复杂性和交叉污染风险。同时，其检测限达到1.6 × 10?3 U/mL，远低于传统方法的检测限，表明其具有更高的灵敏度。此外，该系统在不同细胞样本中表现出良好的特异性，能够准确区分癌细胞与正常细胞中的FEN1水平。

研究人员在本工作中还强调了该技术在精准医学中的应用潜力。通过结合CRISPR-Cas12a的信号放大功能与HCR的自扩增特性，DHC系统不仅提高了FEN1检测的准确性和灵敏度，还简化了实验操作流程，使得该技术更适用于临床环境。此外，该方法还具有良好的可重复性，为大规模检测和药物筛选提供了可靠的技术支持。

为了确保检测的准确性和可靠性，研究人员对DHC系统进行了全面的表征。通过电泳分析、荧光显微镜观察和信号响应测试，确认了该系统的各个组成部分能够有效协同工作。实验结果表明，DHC系统能够在不同浓度的FEN1样本中保持稳定的信号输出，并且能够准确反映FEN1的活性水平。这些结果为该技术在临床和研究中的进一步应用奠定了基础。

综上所述，这项研究通过创新性的设计，构建了一种无需酶参与的双级放大生物传感器，用于对FEN1进行超高灵敏度的检测。该系统不仅提高了检测的准确性，还简化了实验流程，使得FEN1的检测更加高效和可靠。同时，该技术还具有良好的应用前景，能够用于癌症相关研究和药物开发。研究人员相信，这种新型的检测方法将在未来为精准医学的发展提供重要的技术支持。