基于银修饰的蒽醌衍生物的N-乙酰半胱氨酸检测方法

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Emission based sensing of N-acetyl cysteine via silver equipped anthraquinone derivatives

荧光探针检测N-乙酰半胱氨酸的金属螯合机制研究

　　本研究探讨了两种新型蒽醌衍生物（DHA-dibutanenitrile 和 DHA-dibenzonitrile）与银离子形成的复合物在检测 N-乙酰半胱氨酸（NAC）和硫醇酸方面的发射响应特性。通过与银纳米颗粒（AgNPs）的相互作用，这些探针能够实现金属螯合和荧光猝灭，而当加入 NAC 或硫醇酸时，荧光信号则会恢复，从而形成一种基于强度变化的“关-开”型传感机制。该机制具有高灵敏度和选择性，特别适用于生物样品、药物分析以及体液中的检测。研究中还对探针的化学结构、响应特性、以及在不同条件下的稳定性进行了深入分析。

N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种重要的化合物，在医学、生物化学和治疗领域具有广泛的应用。其抗氧化、祛痰、解毒和抗炎作用使其成为治疗慢性支气管炎、其他呼吸道感染、囊性纤维化、与氧化应激相关的疾病（如帕金森病和阿尔茨海默病）、心血管疾病、糖尿病并发症以及慢性炎症的重要药物。此外，NAC 是治疗对乙酰氨基酚（扑热息痛）中毒的标准解毒剂。由于 NAC 不是体内正常循环的代谢物，除非作为药物或补充剂摄入，因此在药物分析、生物样品和环境样品中对其浓度进行检测是必要的。NAC 在体液中的分布和代谢主要发生在肝脏、大脑和肺部，其中主要代谢产物为半胱氨酸和谷胱甘肽。因此，对 NAC 的分析通常涉及血浆、尿液和组织样本，以研究其药代动力学特性、代谢过程和治疗效果。

目前，NAC 的检测方法主要包括高效液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS）和高效液相色谱（HPLC），这些方法在检测 NAC 的 ng/mL 到 μg/mL 级别浓度时表现出良好的准确性和稳定性。此外，循环伏安法、安培法、差分脉冲伏安法和方波伏安法（SWV）也被用于 NAC 的检测，因为其分子中含有容易被氧化的 -SH 基团。然而，这些方法在某些情况下可能存在局限性，尤其是在检测低浓度 NAC 时。因此，研究者们致力于开发更灵敏、更稳定的检测手段，其中荧光法因其高灵敏度和选择性而受到关注。

荧光法通常涉及两种策略：一种是直接利用 NAC 的内源性反应诱导荧光进行检测，另一种是通过 NAC 与荧光探针的反应来实现检测。由于 NAC 本身不具有强烈的荧光特性，但其 -SH 基团可以与适当的化合物发生反应，因此需要设计能够与 NAC 发生特异性反应的探针。这些探针不仅在荧光光谱分析中具有重要价值，而且在色谱分离后，还能显著增强荧光检测器的信号强度，从而提高检测的灵敏度和准确性。

近年来，研究者们开发了多种基于金属离子的荧光探针用于 NAC 的检测。例如，Wang 等人使用发光碳点（CDs）设计了一种基于银离子的荧光探针，该探针在与银离子结合时会发生荧光猝灭，而在 NAC 存在时，荧光信号会恢复。他们报道了该探针的检测范围为 0.04–5.00 mmol/L，检测限为 0.03 mmol/L。此外，Alvarez 等人利用商业探针 SemKur，该探针由荧光素作为荧光供体和 p-甲基红作为荧光受体组成，通过荧光共振能量转移（FRET）机制实现荧光猝灭。他们通过将探针加载到皮层神经元中，监测细胞内 NAC 浓度的变化，并在生理相关的浓度范围内（0–50 mM）进行研究。Cecen 等人则开发了一种基于喹啉的化学传感器，用于连续检测 Cu2? 和 NAC，并在智能手机平台、真实样品和活细胞成像中进行了应用。他们报道了该探针的检测限为 77.42 μM，结合常数为 2.23 × 10?3 M?1。

虽然基于分光光度法的检测方法在分析 NAC 时具有较宽的检测范围和较低的检测限，但在某些情况下仍需要更灵敏的荧光探针。因此，本研究选择两种新型蒽醌衍生物，分别带有 -dibutanenitrile 和 -dibenzonitrile 基团，并结合银纳米颗粒进行检测。这些探针在 Ag-free 状态下表现出较高的摩尔消光系数和量子产率，而在与银纳米颗粒结合后，会发生显著的荧光猝灭，并在加入 NAC 后恢复荧光信号。该机制具有快速响应、良好的重复性和在短、长期内的光稳定性，从而适用于多种分析场景。

在本研究中，对两种探针的化学结构进行了详细描述。DHA-dibutanenitrile 和 DHA-dibenzonitrile 分别由蒽醌核心和两个硝基基团（-CN）组成，这些硝基基团通过醚键连接在蒽醌分子的 1 和 4 位。这种结构设计使得探针在与银纳米颗粒结合后，能够发生有效的金属螯合和荧光猝灭，而当加入 NAC 后，由于 NAC 的 -SH 基团能够与硝基基团发生反应，从而恢复荧光信号。这种响应机制不仅提高了检测的灵敏度，还增强了对 NAC 的选择性，使其能够在复杂样品中有效区分其他分子。

为了进一步研究这些探针的性能，本文对多种干扰因素进行了分析，包括在生理液中可能存在的 Na?、K?、Ca2?、Mg2?、HCO??、SO?2?、NO??、NO??、F? 和 Cl? 等离子。这些离子可能影响探针的荧光响应，因此在实验中需要对其干扰效应进行评估。通过使用 Job's 方法和密度泛函理论（DFT）计算，本文对探针与银离子形成的复合物的化学计量比进行了研究，并提供了优化检测条件的依据。

实验结果显示，在 pH 9.0 条件下，这两种探针表现出最佳的分析性能。此时，NAC 分子中的羧基完全去质子化，酰胺基保持中性，而 -SH 基团部分去质子化，使得 NAC 主要以阴离子形式存在，从而能够选择性地与螯合的银离子发生反应。这种选择性反应确保了探针在复杂样品中的稳定性，提高了检测的准确性。此外，通过实验还发现，这些探针在与银纳米颗粒结合后，能够快速响应 NAC 的存在，并在加入 NAC 后迅速恢复荧光信号，从而实现了高效的检测。

在实验过程中，对 DHA-dibutanenitrile 和 DHA-dibenzonitrile 的吸收、激发和发射光谱进行了详细研究。这些探针在极性非质子溶剂（如 THF）中表现出显著的溶剂效应，特别是在与银纳米颗粒结合后，其荧光猝灭效应更加明显。通过计算 pKa 值，本文还分析了 pH 对探针性能的影响，确保在最佳 pH 条件下进行检测。此外，通过 FT-IR 测量，对探针的化学结构和与银离子的相互作用进行了进一步确认。

研究结果表明，Ag 协调作用和随后的 NAC 结合显著改变了蒽醌衍生物的局部亲核和亲电区域，从而调节了其整体电子结构和反应性。这种改变使得探针在与 NAC 结合后能够恢复荧光信号，形成一种基于强度变化的传感机制。通过实验还发现，DHA-dibutanenitrile 和 DHA-dibenzonitrile 在与银纳米颗粒结合后，其检测范围和检测限分别为 1.0 × 10?? M - 1.0 × 10?2 M 和 1.28 × 10?? 到 1.21 × 10?? mol/L。这些结果表明，这两种探针在检测 NAC 时具有较高的灵敏度和选择性，适用于多种分析场景，包括药物分析、体液检测和生物样品分析。

本研究还对探针的稳定性进行了评估，包括在不同条件下的重复性和光稳定性。结果表明，这两种探针在与银纳米颗粒结合后，能够保持良好的重复性，并在短、长期内表现出优异的光稳定性。这种稳定性确保了探针在实际应用中的可靠性，提高了检测的准确性。此外，通过实验还发现，这些探针在与银纳米颗粒结合后，能够快速响应 NAC 的存在，并在加入 NAC 后迅速恢复荧光信号，从而实现了高效的检测。

在实验中，对多种干扰因素进行了分析，包括在生理液中可能存在的 Na?、K?、Ca2?、Mg2?、HCO??、SO?2?、NO??、NO??、F? 和 Cl? 等离子。这些离子可能影响探针的荧光响应，因此在实验中需要对其干扰效应进行评估。通过实验发现，这些探针在与银纳米颗粒结合后，能够有效排除这些干扰因素的影响，从而实现对 NAC 的高选择性检测。

此外，本研究还对探针的化学结构进行了详细描述，并提供了相应的结构图（Scheme 1）。这些结构图展示了探针的分子组成和与银纳米颗粒的相互作用方式，为理解其检测机制提供了重要依据。通过实验还发现，这些探针在与银纳米颗粒结合后，能够形成稳定的复合物，并在加入 NAC 后迅速恢复荧光信号，从而实现了高效的检测。

本研究的成果表明，银纳米颗粒与蒽醌衍生物的结合能够显著提高对 NAC 的检测灵敏度和选择性。通过实验还发现，这些探针在与银纳米颗粒结合后，能够形成稳定的复合物，并在加入 NAC 后迅速恢复荧光信号，从而实现了高效的检测。这种检测机制不仅适用于实验室环境，还具有实际应用价值，特别是在药物分析、生物样品检测和环境监测等领域。

总之，本研究通过设计两种新型蒽醌衍生物，并结合银纳米颗粒，开发了一种高效、灵敏、选择性强的荧光探针，用于检测 NAC 和硫醇酸。这些探针在与银纳米颗粒结合后，能够发生有效的金属螯合和荧光猝灭，并在加入 NAC 后迅速恢复荧光信号，从而实现了基于强度变化的传感机制。该机制具有良好的重复性和光稳定性，适用于多种分析场景，并在生理相关的 pH 条件下表现出最佳的检测性能。研究结果为 NAC 的检测提供了新的方法，并展示了其在实际应用中的潜力。