肠道驯化中性粒细胞通过NETs激活Kupffer细胞加剧脓毒症肝损伤的机制研究

《Nature Communications》：Gut-primed neutrophils activate Kupffer cells to promote hepatic injury in mouse sepsis

本研究针对脓毒症诱导肝损伤的机制不明问题，通过开展肠道-肝脏免疫细胞交互作用研究，发现肠道上皮内淋巴细胞(IELs)通过CD112促进中性粒细胞形成NETs，经门静脉迁移至肝脏后通过中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)-蛋白酶激活受体1(PAR-1)轴激活Kupffer细胞，导致肝细胞死亡。该研究揭示了器官间免疫细胞对话新机制，为脓毒症肝损伤治疗提供了新靶点。

　　

脓毒症作为一种由感染引发的严重炎症性疾病，每年影响全球约5000万患者，是重大的公共卫生挑战。其中肝脏衰竭是脓毒症的常见并发症，与疾病严重程度密切相关。尽管肝脏在代谢和免疫稳态中起关键作用，但脓毒症期间其解毒功能受损、代谢改变及凝血失调往往导致不良预后。更棘手的是，肝脏本身产生的促炎介质会进一步加剧组织损伤。然而，脓毒症诱导肝损伤的具体分子机制尚未完全阐明，特别是肠道与肝脏这两个紧密相连的器官之间的免疫细胞对话机制值得深入探索。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员从细胞生物学角度揭示了脓毒症中肠道驱动肝损伤的新机制。他们发现肠道来源的中性粒细胞在迁移至肝脏过程中，通过释放中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil Extracellular Traps, NETs)激活肝脏驻留巨噬细胞——Kupffer细胞，最终导致肝细胞死亡。这一发现不仅阐明了器官间免疫细胞对话的具体途径，还为脓毒症肝损伤的治疗提供了新的潜在靶点。

研究团队采用了几项关键技术方法：通过盲肠结扎穿孔(CLP)建立小鼠脓毒症模型；采用胶原酶灌注法和梯度离心分离肝细胞、Kupffer细胞及非实质细胞；通过流式细胞术检测NETs形成（Cit-H3⁺MPO⁺中性粒细胞）和Kupffer细胞iNOS表达；利用体外共培养系统研究免疫细胞间相互作用；采用计算机模拟预测蛋白质分子相互作用；通过过继转移实验验证体内细胞功能。

NETs激活Kupffer细胞在脓毒症中的作用

研究人员首先发现脓毒症小鼠肝脏中形成NETs的中性粒细胞频率和数量均显著增加。通过使用PAD4^-/-小鼠（其中性粒细胞因无法催化组蛋白瓜氨酸化而缺陷于NETs形成），他们证实NETs是导致Kupffer细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达升高的关键因素。体外实验显示，NETs以时间和剂量依赖性方式刺激Kupffer细胞产生IL-6和TNF。更重要的是，NET处理的Kupffer细胞条件培养基可诱导肝细胞死亡，而NETs本身直接处理肝细胞则无此效应，表明Kupffer细胞激活是肝损伤的中介环节。

NETs通过PAR-1激活Kupffer细胞

为探究NETs激活Kupffer细胞的机制，研究人员关注了NETs中含有的蛋白酶及其可能激活的蛋白酶受体。蛋白酶抑制剂显著降低了NETs诱导的IL-6和TNF释放。计算机模拟预测中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil Elastase, NE)与PAR-1的前肽区域(Asp35-Leu55)结合，表明NE可切割并蛋白水解激活PAR-1。NE抑制剂和PAR-1抑制剂均以剂量依赖性方式减弱NETs诱导的细胞因子释放，其中PAR-1抑制剂在高剂量时使IL-6和TNF分别降低67%和46%，证实NE-PAR-1轴在Kupffer细胞激活中的关键作用。

肠道来源中性粒细胞产生NETs激活Kupffer细胞

研究人员通过比较全身血液和门静脉血液中的中性粒细胞发现，脓毒症小鼠门静脉中性粒细胞产生更多NETs，且与Kupffer细胞共培养时诱导更强的IL-6和TNF产生。使用PAD4^-/-小鼠证实这一效应依赖于NETs形成。过继转移实验进一步显示，与WT门静脉脓毒症中性粒细胞相比，PAD4^-/-来源的中性粒细胞转移后脓毒症小鼠Kupffer细胞中iNOS、IL-6和TNF的mRNA表达显著降低，证实肠道训练的中性粒细胞通过NETs激活Kupffer细胞。

中性粒细胞与肠道IELs通过CD112相互作用诱导NETs形成

研究发现在脓毒症小鼠肠道上皮中中性粒细胞数量增加且与IELs直接接触。体外共培养实验表明，IELs可增强LPS刺激的中性粒细胞NETs形成。机制上，脓毒症小鼠肠道上皮中CD112⁺中性粒细胞增多，抗CD112抗体处理显著减弱了IELs诱导的NETosis，表明CD112介导的细胞相互作用是NETs形成的关键。

中性粒细胞与IELs相互作用激活Kupffer细胞并导致肝损伤

IELs预处理的 neutrophils 与Kupffer细胞共培养时诱导更强的IL-6和TNF产生，这一效应可被PAR-1抑制剂减弱。在脓毒症小鼠中，过继转移IELs预处理的 neutrophils 显著增加Kupffer细胞iNOS、IL-6和TNF表达，并升高血清AST和ALT水平。当使用抗CD112抗体处理时，这些指标均下降，证实IELs通过CD112促进中性粒细胞NETosis，进而激活Kupffer细胞导致肝损伤。

研究结论与讨论部分强调，该研究揭示了脓毒症中肠道-肝脏轴的新型免疫细胞对话机制：肠道IELs通过CD112促进中性粒细胞形成NETs，这些NETs经门静脉迁移至肝脏后，通过NE-PAR-1轴激活Kupffer细胞，导致炎症因子释放和肝细胞死亡。这一发现不仅深化了对脓毒症多器官功能障碍机制的理解，更重要的是提出了靶向CD112介导的IEL-中性粒细胞相互作用或PAR-1介导的NET-Kupffer细胞相互作用的治疗新策略。研究人员指出，虽然NETosis被视为一种细胞死亡形式，但肠道训练的中性粒细胞可能在仍具迁移能力时到达肝脏后才释放NETs。此外，类似的机制也可能存在于肠道局部，NETs可能激活固有层巨噬细胞导致上皮损伤。该研究为开发针对脓毒症肝损伤的精准疗法提供了理论基础，未来需要进一步探索细胞追踪技术、不同脓毒症模型及性别年龄等因素的影响。