PB-TRIBE-STAMP技术揭示处理小体mRNA动态调控新机制：从单细胞分辨率到细胞周期动态分析

《Nature Communications》：Systematic characterization of the composition and dynamics of processing body-associated mRNAs

本研究针对处理小体（P-bodies, PBs）相关mRNA系统性鉴定技术不足的瓶颈，开发了PB-TRIBE-STAMP工具，通过双正交RNA编辑酶（APOBEC1-DDX6/LSM14A-ADAR2dd）在HCT116和HEK293T细胞中分别鉴定出1639和2577个PB相关mRNA。结合长读长测序发现PB关联转录本具有较短poly(A)尾，且3'UTR亚型呈现特异性PB聚集模式；进一步通过TRIBE-ID技术揭示XBP1 mRNA在未折叠蛋白反应（UPR）中与LSM14A/PB动态关联促进剪接效率，并在单细胞水平解析细胞周期进程中mRNA-PB相互作用的动态规律，为RNA相分离调控研究提供高时空分辨率新范式。

在真核细胞中，处理小体（P-bodies, PBs）作为无膜细胞器，通过液-液相分离形成，富集mRNA脱帽、降解及翻译抑制相关蛋白，长期以来被视为mRNA储存和降解的关键场所。然而，由于技术限制，系统性鉴定PB相关mRNA的方法仍面临挑战：传统技术如交联免疫沉淀（CLIP）和荧光激活颗粒分选（FAPS）需大量起始材料，无法实现单细胞分辨率分析，且难以捕捉mRNA与PB相互作用的动态过程。

为解决这一难题，南方科技大学陈炜/方亮团队在《Nature Communications》发表研究，开发了PB-TRIBE-STAMP技术，首次实现PB相关mRNA的高置信度鉴定及动态追踪。该技术融合两种正交RNA编辑酶（APOBEC1与ADAR2dd）与PB核心蛋白（如DDX6、LSM14A），通过RNA编辑标记PB关联转录本，结合长短读长测序与单细胞分析，系统解析PB-mRNA相互作用的组成特征、动态规律及生物学意义。

关键技术方法概述

研究通过以下核心方法展开：

1. 1.1.
   PB-TRIBE-STAMP构建：将APOBEC1或ADAR2dd与9种PB核心蛋白（如DDX6、LSM14A）融合，筛选出编辑效率最高的组合（APOBEC1-DDX6/LSM14A-ADAR2dd）共表达于HCT116和HEK293T细胞；
2. 2.2.
   FAPS验证：通过荧光激活颗粒分选分离PB，RNA-seq证实编辑转录本富集于PB；
3. 3.3.
   长读长测序（ONT）：分析poly(A)尾长度与3'UTR亚型特异性PB关联；
4. 4.4.
   TRIBE-ID动态追踪：利用雷帕霉素诱导二聚化系统（FKBP-ADAR2dd/LSM14A-FRB）研究UPR过程中XBP1 mRNA剪接动力学；
5. 5.5.
   单细胞sc-LSM14A-TRIBE-ID：基于Smart-seq3xpress技术解析细胞周期中mRNA-PB相互作用动态。

研究结果

1. PB-TRIBE-STAMP高效鉴定PB相关mRNA

通过比较32种PB蛋白-编辑酶融合蛋白的编辑效率，发现APOBEC1-DDX6和LSM14A-ADAR2dd在HCT116和HEK293T细胞中分别标记1639和2577个PB相关mRNA，重叠率高达85%。FAPS分离验证编辑转录本显著富集于PB，且与LSM14A-FAPS数据集高度重叠（68%）。

2. PB关联转录本特征：较短poly(A)尾与3'UTR亚型特异性

ONT长读长测序显示，PB关联mRNA的poly(A)尾长度显著短于非关联mRNA，且双编辑事件频率与poly(A)尾缩短程度正相关。进一步发现长3'UTR亚型更易富集于PB，如SREBF2的长亚型通过smFISH和RIP-qPCR验证其PB定位优势。

3. LSM14A-TRIBE-ID揭示XBP1 mRNA在UPR中的高效剪接

通过雷帕霉素诱导的TRIBE-ID系统，发现LSM14A关联的XBP1未剪接转录本（XBP1u）在内质网应激（Thapsigargin诱导）下剪接为XBP1s的效率显著高于非关联转录本，提示PB邻近ER可能促进XBP1 mRNA的IRE1α介导剪接。

4. 单细胞水平解析细胞周期中mRNA-PB动态关联

sc-LSM14A-TRIBE-ID分析显示，mRNA-PB关联在细胞周期过渡点（如G2/M至G1期）发生显著变化，且编辑水平与RNA丰度变化呈中度正相关，表明PB解离可能导向mRNA降解。

结论与意义

本研究开发的PB-TRIBE-STAMP技术突破了传统方法在分辨率与动态分析上的局限，首次系统描绘PB相关mRNA图谱，并揭示其poly(A)尾缩短、亚型特异性聚集等分子特征。通过TRIBE-ID与单细胞技术，证实PB在UPR应激响应与细胞周期调控中扮演动态调节角色，为理解相分离细胞器的RNA调控网络提供了高时空分辨率研究范式。该技术可拓展至其他无膜细胞器研究，为RNA代谢异常相关疾病（如癌症、神经退行性疾病）的机制探索提供新工具。