突破交联质谱技术瓶颈：Orbitrap Astral平台通过提升通量和灵敏度实现更全面的蛋白质相互作用解析

《Nature Communications》：Breaking barriers in crosslinking mass spectrometry with enhanced throughput and sensitivity using Orbitrap Astral

本文编辑推荐：研究人员为提升交联质谱(CLMS)技术在解析蛋白质相互作用和三维结构中的性能，系统比较了Orbitrap Astral和Orbitrap Eclipse质谱平台。研究发现，Astral凭借其更高的MS1灵敏度、更快的扫描速度以及对低丰度前体的高效检测能力，使独特残基对(URP)的鉴定数量提升40%以上。FAIMS技术的引入进一步将鉴定效率提高30%。此外，研究证实单能高阶碰撞解离(HCD)在Astral平台上的表现优于阶梯式HCD，且色谱梯度优化和色谱柱选择对交联肽段的分离效率有显著影响。该研究为蛋白质结构研究提供了重要的方法学优化方案和技术选型依据。

在生命科学领域，揭示蛋白质的三维结构和相互作用网络是理解其生物学功能的关键。交联质谱(Crosslinking Mass Spectrometry, CLMS)技术作为一种强大的工具，通过化学交联剂将空间距离接近的氨基酸残基共价连接，再通过质谱分析来获取蛋白质的结构信息和相互作用界面。与传统结构生物学技术如冷冻电镜(cryo-EM)和X射线晶体学相比，CLMS能够捕获溶液中蛋白质的动态构象变化和瞬态相互作用，为理解细胞机器的精细运作提供了独特视角。

然而，CLMS技术的广泛应用面临诸多挑战。交联肽段在复杂样品中通常丰度极低，对质谱仪的灵敏度、扫描速度和分辨率提出了极高要求。此外，交联肽段的质谱图谱解析复杂，需要高效的碎裂方法和数据分析算法。随着新型可裂解交联剂(如DSSO)和光活化交联剂(如PhoX)的发展，对质谱仪器性能的要求也日益提高。近年来，Thermo Scientific公司推出的Orbitrap Astral和Orbitrap Eclipse质谱仪引入了新的技术突破，但它们在CLMS工作流程中的性能差异尚未有系统评估。

为了解决这些问题，由Franze Miller领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果，系统比较了Orbitrap Astral和Eclipse在CLMS工作流程中的性能差异。研究人员采用标准化的色谱和采集条件，使用PhoX和DSSO两种交联剂交联的Cas9蛋白作为质量控制(QC)样品，全面评估了两种仪器在鉴定效率、灵敏度、碎裂策略和色谱条件优化等方面的表现。

关键技术方法方面，研究团队建立了标准化的CLMS工作流程。使用Cas9-Halo蛋白与PhoX或DSSO交联剂进行交联反应，通过溶液内酶切制备肽段样品。质谱分析采用配备FAIMS Pro Duo接口的Orbitrap Eclipse或Orbitrap Astral质谱仪，结合纳升液相色谱系统。色谱分离使用25 cm IonOpticks Aurora Ultimate色谱柱或50 cm Thermo PepMap色谱柱进行比较。数据采集采用数据依赖采集(DDA)模式，系统比较了单能HCD和阶梯式HCD碎裂策略。数据分析使用Proteome Discoverer软件平台，结合MS Annika交联搜索算法进行交联肽段鉴定，假发现率(FDR)控制在1%水平。

方法优化与性能比较

研究人员首先对Orbitrap Astral的采集参数进行了系统优化。通过测试不同自动增益控制(AGC)目标和注入时间(IT)设置，发现较低的AGC设置(500)和较短的注入时间(6 ms)能够在保持蛋白质鉴定数量的同时显著提高MS1质量精度。FAIMS补偿电压(CV)优化实验确定了-48 V/-60 V/-75 V为最佳组合，使独特残基对鉴定数量增加30%。

仪器性能比较显示，Orbitrap Astral在鉴定独特交联数量方面显著优于Eclipse。对于PhoX交联的Cas9样品，Astral在250 ng进样量时鉴定出的独特残基对数量比Eclipse多40%以上。类似趋势在DSSO交联样品中也得到证实，Astral在500 ng进样量时鉴定效率优势同样超过40%。即使在低至1 ng的进样量下，Astral仍能鉴定出192个(PhoX)和121个(DSSO)独特残基对，展现了其卓越的灵敏度。

FAIMS技术增强交联鉴定

高场不对称波形离子迁移谱(FAIMS)技术的应用进一步提升了Astral平台的性能。研究发现，FAIMS通过降低背景"噪声"和简化离子分布，显著提高了低丰度交联肽段的检测能力。在250 ng进样量时，FAIMS特异性鉴定的交联占总数的48%，与非FAIMS测量仅有14%的重叠，表明FAIMS能够有效富集传统方法难以检测的交联物种。

碎裂策略优化

在碎裂策略比较中，研究团队发现了与先前报道不同的结果。传统认为阶梯式HCD对可裂解交联剂更有效，但在Astral平台上，单能HCD consistently优于阶梯式HCD。对于PhoX交联样品，单能HCD在250 ng进样量时产生909个独特残基对，而阶梯式HCD仅产生726个，鉴定效率提升25%。这种优势在DSSO交联样品中更为明显，在1 ng低进样量时单能HCD比阶梯式HCD性能提升39%。

研究人员认为，这种性能差异主要源于Astral平台的高效离子传输和快速扫描能力。单能HCD允许高达220 Hz的采集速度，而阶梯式HCD由于包含多个碰撞能级，扫描速度降至约80 Hz。这种速度优势使Astral能够更有效地利用 duty cycle，特别是在低丰度分析物检测中表现突出。

色谱条件优化

梯度优化实验表明，延长色谱分离时间能显著提升纯净或富集样品中的交联鉴定数量。对于250 ng PhoX交联的Cas9样品，梯度时间从10分钟延长至180分钟时，独特残基对鉴定数量从45个增加至436个，增幅达868.9%。这种提升主要归因于每个独特交联获得的CSM支持数量增加，从短梯度时的平均2.5个CSM/交联提升至最长梯度时的12个CSM/交联。

然而，在复杂背景样品(如E.coli核糖体与HeLa裂解液混合样品)中，延长梯度的益处存在平台效应。超过70分钟后，单链接鉴定数量趋于稳定，而独特交联鉴定数量始终维持在较低水平(最多8个独特残基对)。这表明在复杂样品中，仅依靠延长梯度时间不足以显著提升鉴定深度，需要结合交联富集或复合物分离策略。

色谱柱性能比较

研究人员还比较了50 cm PepMap色谱柱和25 cm Aurora Ultimate色谱柱的性能差异。尽管PepMap柱长度更长(50 cm对25 cm)，但Aurora柱凭借其更小的粒径(1.7 μm对2 μm)和更大的孔径(120 ?对100 ?)，在交联肽段分离中表现出更优性能。在100 ng进样量时，Aurora柱鉴定出779个独特残基对，而PepMap柱仅鉴定出560个，性能提升28%。分析显示，Aurora柱产生的色谱峰更尖锐，强度更高，这主要归因于其更优的色谱分离效率和更适合大分子交联肽段的孔径特性。

研究结论与意义

本研究系统评估了Orbitrap Astral和Eclipse在交联质谱工作流程中的性能差异，为蛋白质结构研究领域提供了重要的方法学指导。研究结果表明，Astral平台凭借其卓越的灵敏度、快速的扫描速度以及对低丰度前体的高效检测能力，能够鉴定出比Eclipse多40%以上的独特交联，为深入解析蛋白质相互作用网络提供了强有力的技术支持。

特别值得关注的是，研究发现交联丰度与结构可及性密切相关。高丰度交联主要定位于蛋白质表面可及区域，而低丰度交联则更多映射到蛋白质内部或较少可及的区域，这些低丰度交联往往反映了结构或功能上重要的相互作用。这一发现为开发新的采集策略提供了思路，如基于MS1前体强度的内部分馏策略，可优先靶向低丰度交联物种，从而增强CLMS实验的灵敏度和可解释性。

在方法学层面，研究澄清了碎裂策略的选择标准。与传统认知不同，在高速扫描平台如Orbitrap Astral上，单能HCD通过最大化 duty cycle而展现出性能优势，特别是在低样品量情况下。这一发现强调了CLMS中仪器特异性优化的重要性。

此外，色谱条件优化实验为实验设计提供了实用指导：对于纯净或富集样品，延长梯度时间可显著提升鉴定深度；而对于复杂样品，则需要结合富集策略而非单纯延长梯度。色谱柱选择也证明是影响分离效率的关键因素，Aurora柱凭借其更适合交联肽段的物理参数而展现出性能优势。

总的来说，这项研究不仅为研究人员选择合适的仪器和优化工作流程提供了详细指导，也推动了交联质谱技术向更高灵敏度、更高通量的方向发展，为在原子水平理解蛋白质结构和功能提供了新的技术支撑。随着仪器技术的不断进步和方法的持续优化，交联质谱必将在结构生物学和系统生物学研究中发挥越来越重要的作用。