深海未培养微生物来源的PET水解酶的发现及其在塑料降解中的应用

《The ISME Journal》：Plastic degradation by enzymes from uncultured deep sea microorganisms

本研究针对全球PET塑料污染问题，从热液影响的深海沉积物宏基因组数据中挖掘新型PET降解酶。研究人员通过隐马尔可夫模型筛选、异源表达及功能验证，首次发现一种来源于Bathyarchaeia古菌的PETase（GuaPA）和两种细菌来源的BHETase，其中GuaPA能在60°C下降解低结晶度PET薄膜，与BHETase联用可提升降解效率68%。该研究揭示了深海微生物降解人工聚合物的生态潜力，为塑料生物回收提供了新型高温高效酶资源。

　　

每年全球生产的塑料超过3.9亿吨，其中聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）占比高达6.2%，大量PET被用于一次性包装，最终进入自然环境形成持久性污染。尽管PET水解酶（PETase）的发现为塑料降解提供了绿色解决方案，但现有酶资源多来源于陆地环境（如堆肥或废水），且筛选策略易受已知酶序列相似性限制，导致新酶多样性挖掘不足。更关键的是，多数已报道的PETase对高结晶度的消费后PET制品（如薄膜）降解效率低，且耐热性较差，难以满足工业应用需求。

为突破这一瓶颈，美国德克萨斯大学奥斯汀分校的研究团队将目光投向深海——全球塑料污染的“终极汇聚地”。位于加利福尼亚湾的瓜伊马斯盆地（Guaymas Basin）热液区沉积物中富含烃类物质，其微生物群落可能演化出降解石油基聚合物（如PET）的能力。研究团队利用宏基因组学技术，对该区域2000米深的海底沉积物样本进行大规模测序，构建包含778万个蛋白质序列的数据库，并通过隐马尔可夫模型（HMM）从300个候选酶中筛选出22个具有热稳定性和系统发育新颖性的潜在PETase。

经异源表达和功能验证，研究人员首次发现一种来源于Bathyarchaeia古菌的PETase（命名为GuaPA），能在60°C下48小时内从低结晶度PET薄膜中释放3-5 mM的对苯二甲酸（TPA）和单羟乙基对苯二甲酸酯（MHET）。同时，两种来自未培养细菌（Poribacteria和Thermotogota）的BHET水解酶（B1和B4）可高效降解PET中间产物BHET。值得注意的是，GuaPA与B1联用时，对未处理PET薄膜的降解效率提升68%。酶学性质分析显示，GuaPA的熔解温度（T_m）达79°C，且其活性在200 mM磷酸盐缓冲液（pH 8）和60°C条件下最优。

结构预测表明，GuaPA具有独特的扩展环区（12个氨基酸，而典型PETase仅为3-6个），增加了活性位点附近的疏水界面，可能促进其与PET链的结合。此外，GuaPA表面呈高度负电性（等电点pI=4.9），且缺乏二硫键，其热稳定性可能由33个芳香族残基间的π-π相互作用网络维持。这些特征使其区别于已知的I型或II型PETase，成为酶工程改造的优质模板。

基因组代谢通路分析进一步揭示，编码GuaPA的Bathyarchaeia宏基因组组装基因组（MAG）含有完整的TPA至原儿茶酸（protocatechuate）转化途径，而B1和B4的宿主基因组则具备乙二醇（EG）代谢相关酶系，表明这些微生物可能通过共生关系协同降解PET产物。

关键实验方法概述

研究基于瓜伊马斯盆地热液沉积物宏基因组数据（NCBI BioProject PRJNA1112871），通过HMMER软件构建PETase隐藏马尔可夫模型筛选候选酶，利用ESMFold预测蛋白结构，并通过Foldseek进行结构比对。候选基因经密码子优化后于大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达，镍柱纯化后通过高效液相色谱（HPLC）量化PET及BHET降解产物。酶动力学参数通过差示扫描荧光法（DSF）及反应条件优化实验测定。

研究结果

1. 深海热液微生物中PET水解酶的鉴定

通过宏基因组HMM筛选，研究人员获得22个候选酶，其与已知PETase（如IsPETase和LCC）的平均序列相似性仅为27.6%。高温（60°C）筛选显示，仅GuaPA可降解无定形PET薄膜，而B1和B4在30°C下能水解BHET生成TPA和MHET。

2. GuaPA的酶学性质优化

GuaPA在200 mM磷酸盐缓冲液（pH 8）、60°C及低酶浓度（100 nM）条件下活性最高。去除推测的信号肽（24个氨基酸）对其活性无显著影响，且酶活性在稀释后未出现可逆失活。

3. 酶联用提升PET降解效率

GuaPA与B1以1:2比例联用时，对8%结晶度PET薄膜的降解产物总量提升至4.6 mM（TPA占比88%）。值得注意的是，GuaPA主要释放PET寡聚物（endo-PETase活性），而B1可进一步降解这些寡聚物，说明二者功能互补。

4. GuaPA的结构特性

与典型PETase相比，GuaPA的扩展环区增加了疏水相互作用界面，其表面负电性及缺乏二硫键的特征挑战了以往对PETase结构功能的认知。芳香族残基网络可能是其热稳定性的关键因素。

5. PET降解产物的代谢潜能

结构同源搜索发现，GuaPA宿主基因组具备将TPA通过2,3-或4,5-间位裂解途径整合至中心代谢的能力，而B1和B4的宿主基因组含有EG氧化相关酶系，暗示深海微生物群落可能通过代谢分工实现PET的完全矿化。

结论与意义

本研究首次从深海未培养微生物中发掘出具有高温活性的古菌来源PETase（GuaPA）及细菌BHETase，突破了现有酶资源筛选的序列同源性限制。GuaPA的独特结构特征（如扩展环区、负电表面及π-π稳定网络）为理性设计高性能PET降解酶提供了新思路。酶联用策略显著提升PET薄膜降解效率，印证了合成微生物群落构建在塑料生物回收中的潜力。此外，深海沉积物中大量未培养微生物的PET降解能力提示，海洋生态系统可能是新型塑料降解酶的重要资源库。该研究发表于《The ISME Journal》，为解决塑料污染问题提供了从酶发现到生态机制解析的全链条科学依据。