揭示在中国西南部喀斯特地区酸性土壤中，磷的有效性对不同耐磷紫花苜蓿（Medicago sativa L.）的生长、根系形态及生理特性的影响

《Environmental and Experimental Botany》：Unveilling the impact of phosphorus availability on growth, root morphological and physiological traits of different phosphorus-tolerant alfalfa ( Medicago sativa L.) in acidic soils in the karst region of southwest China

本研究通过盆栽实验，比较了耐铝（Trifecta）和敏感（Longzhong）苜蓿品种在石灰土和黄壤中不同磷水平的生长及根系形态响应。结果表明，磷肥缓解了铝毒，促进根系发育和地上部生长，但过量施磷（>40 mg/kg）会降低土壤pH，增加可交换铝含量，抑制植物生长。耐铝品种在磷利用效率和根系形态指标上优于敏感品种，且黄壤中根系对铝的积累更显著。优化磷肥施用量可提升产量和耐铝性，为酸性土壤苜蓿栽培提供指导。

　　在南方中国，酸性土壤中种植苜蓿（*Medicago sativa* L.）面临诸多挑战，主要由于土壤酸度较低时，磷（P）的缺乏和铝（Al）的毒性。这一研究旨在评估在磷限制和低pH条件下苜蓿根部的形态和生理反应，通过盆栽实验比较了两种苜蓿品种——Al敏感型（Longzhong）和Al耐受型（Trifecta）在酸性土壤中的生长情况。实验中设置了六种磷供应水平（0、10、20、40、80和120 mg P kg?1土壤），并采用了两种典型土壤类型：石灰土（pH 6.01）和黄土（pH 5.46）。研究结果表明，磷的施用可以缓解酸性土壤中的酸铝胁迫，促进苜蓿的生长，但当磷供应超过40 mg P kg?1时，地上部分的生长并未进一步提升。耐受型苜蓿在磷吸收和利用效率方面优于敏感型，同时表现出更长的总根长。在两种土壤类型中，两种苜蓿品种都倾向于将更多的生物量分配给根部，以最大化磷的提取效率。耐受型苜蓿的根部形态特征更优，这有助于其在酸性土壤中提高磷吸收能力和生物量生产。黄土中苜蓿分泌更多的草酸，这是提高磷吸收的一种有效策略。在磷供应为20 mg P kg?1时，耐受型和敏感型的草酸分泌量分别是对照组的1.6倍和2.5倍。然而，过量施用酸性磷肥，如磷酸二氢钙，会导致土壤pH显著下降，交换性铝的浓度增加，最终抑制植物生长。这表明，根据土壤酸性的不同调整磷肥施用策略，可以提高肥料利用率，增强苜蓿的产量和耐受性，不仅为酸铝耐受苜蓿的育种提供了策略，也为该地区的苜蓿种植提供了施肥指导。

苜蓿作为全球种植最广泛的豆科牧草作物，因其高营养价值和良好的适口性而受到广泛重视。在中国北方黄土高原地区，苜蓿种植已有超过150年的历史。近年来，中国对苜蓿的需求迅速增长，苜蓿干草的进口量从2012年的0.44万吨增加到2020年的1.78万吨。然而，苜蓿对土壤酸铝胁迫高度敏感，中国南方的酸性土壤面积达到2.03×10?公顷，占全国耕地面积的21%。这给南方地区的苜蓿种植带来了重大挑战，导致该地区苜蓿产量显著不足。不过，酸性土壤也蕴含着巨大的苜蓿生产潜力，通过培育耐酸铝的苜蓿品种，可以扩大其种植面积，提高产量。因此，理解植物对铝毒性的耐受机制，并识别或培育具有增强耐铝能力的苜蓿品种，对于最大化苜蓿的生产潜力和推动酸性土壤地区的农业和畜牧业发展至关重要。

贵州省作为中国西南地区喀斯特地貌的中心，是该国最大的典型喀斯特地区之一。由于土壤酸化和侵蚀，土壤养分流失严重，生产力大幅下降，黄土和石灰土是该地区的主要土壤类型。生态环境的破坏和经济的滞后使得畜牧业成为恢复生态和促进区域经济发展的重要途径。本研究旨在探讨不同苜蓿品种在两种典型喀斯特土壤中的磷吸收机制，以提高西南地区苜蓿的施肥管理策略。研究重点评估了不同苜蓿品种对磷肥施用的响应机制，以及在不同土壤类型中的磷利用情况。研究假设包括：（i）在酸性土壤中，磷供应不仅能够增加植物的干重、根系质量比和特定根长，还能缓解铝毒对苜蓿的影响；（ii）在低磷供应的土壤中，植物会释放更多的羧酸类物质到根系周围。

研究采用了两种苜蓿品种，Trifecta（耐铝型）和Longzhong（敏感型），这些品种之前已进行评估和筛选。种子由兰州大学牧草科学与技术学院提供。两种典型土壤分别来自贵州省喀斯特地区的石灰土（pH 6.01）和黄土（pH 5.46），取自未受人为干扰的自然草地表层0-15 cm土壤。实验在2021年8月至11月期间于贵州省大学动物科学学院温室中进行，温室维持控制的温度环境（白天25°C，夜间15°C）。实验处理包括对照和五种磷供应水平（10、20、40、80和120 mg P kg?1土壤，以磷酸二氢钙的形式施用）。磷肥作为干粉与空气干燥并过筛的土壤充分混合，以确保磷的均匀分布。每种处理进行了四次重复，实验中未使用其他肥料或根瘤菌接种。实验使用塑料花盆（上口径25 cm，下口径18 cm，深度20 cm），每盆装有2.5 kg土壤（平均粒径<2 mm）。

种子在30%（v/v）的过氧化氢溶液中浸泡5分钟，然后用无菌水冲洗五次。随后在4°C下进行春化处理24小时，并在20°C（白天16小时）和15°C（夜间8小时）的培养箱中萌发3天。每盆播种20粒种子，14天后筛选至每盆9株幼苗。实验期间，两种土壤类型每日浇水至田间持水量的60%。本研究共使用72个花盆（两个品种×两种土壤类型×六种磷供应水平×三次重复），实验采用随机完全区组设计。

在实验结束90天后，植物被收获。地上部分在土壤表面切断，于70°C下干燥72小时并称重。将土壤从花盆中取出，根系与土壤分离，剩余附着在根上的土壤定义为根系土壤。根系被仔细从土壤中取出并清洗，然后使用Epson Perfection V800扫描仪以300 dpi分辨率扫描。根系长度（RL）、根系表面积（RSA）和根系体积通过WinRHIZO图像分析系统测量。根系随后在60°C下干燥48小时并称重，计算根系质量比（RMR）为根系干重（RDW）除以总植物干重。特定根长（SRL）计算为总根长除以总根系干质量。

根系周围羧酸的分析涉及将根系土壤样品过滤至1 mL HPLC小瓶中，使用0.2 μm注射器滤膜过滤。随后用磷酸酸化并储存在-20°C冰箱中。根系周围提取液和标准品通过Agilent 1260 Infinity II HPLC系统分析。使用C-18反相色谱柱（250 × 4.6 mm，5 μm）进行分离，柱温维持在30°C。流动相为25 mM KH?PO?（pH调整至2.4），流速为1.0 mL min?1。工作标准品包括草酸、苹果酸、柠檬酸和苹果酸。根系周围羧酸浓度以单位根系干质量或单位根长表示。

所有土壤样品在去除植物根系后，分别收集、风干并过2 mm筛。使用pH计在1:5土壤-水悬液中测量土壤pH值。土壤有效磷（AP）和总磷（TP）通过钼-锑抗分光光度法测定。土壤交换性铝通过铬氧化氰化法测定。

植物中的磷和铝浓度通过将干燥的地上部分和未提取的根系样品细磨，称取约0.1 g样品，使用王水和过氧化氢进行消化，随后通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）ELAN DRC II分析磷和铝的浓度。每盆植物中每种元素的总含量为地上部分和根系元素含量的总和。

磷吸收效率的计算方法基于Fan等（2015）的方法，即植物地上部分和根系中磷浓度乘以干重之和。磷利用效率定义为单位磷吸收的植物生物量产量，计算方式为总植物干重除以总植物磷含量。

所有参数，包括地上植物生长、地下根系形态参数、磷吸收效率、磷利用效率、铝含量、土壤pH值和根系周围羧酸含量，分别进行单因素方差分析（P水平）和双因素方差分析（基因型×P水平）。每种处理的三组数据进行分析，使用最小显著差（LSD）检验确定处理间的显著性差异。显著性水平设定为P < 0.05。通过皮尔逊相关分析探讨土壤磷组分与其他变量之间的关系。相关性显著的条件为P < 0.05。所有测量变量均使用GenStat 21.0统计软件进行分析，且方差分析假设未经过任何变换即满足。

研究结果表明，磷供应显著影响植物干重，基因型、土壤类型及其交互作用均具有显著影响。在石灰土和黄土中，Trifecta（耐铝型）和Longzhong（敏感型）的植物高度、茎粗和地上部分干重随磷供应量的增加而增加，达到最高值时分别为20 mg P kg?1（Trifecta在黄土中为40 mg P kg?1）。然而，进一步增加磷供应量并未显著改变这些参数。同时，Trifecta的植物高度、茎粗和地上部分干重显著高于Longzhong。在相同磷供应水平下，石灰土中的苜蓿植物高度、茎粗和干重均高于黄土中的。Trifecta和Longzhong在石灰土中的最大干重分别为黄土中的4.3倍和4.0倍。

磷供应对根系生物量和形态的影响取决于基因型、磷供应水平和土壤类型。随着磷供应量的增加，两种土壤类型中Trifecta和Longzhon的根长、根表面积、根体积、根干重和根系质量比均增加，尤其在Trifecta中表现更为显著。除了根表面积外，其他性状的变化趋势与地上部分的生长变化一致。Longzhong在两种土壤中均在20 mg P kg?1时达到最大根长、根体积、根干重和根系质量比，而Trifecta在石灰土和黄土中分别在20 mg P kg?1和40 mg P kg?1时达到最大值。Trifecta在石灰土中的最大根表面积为42.27 cm2/盆，出现在80 mg P kg?1时。

在黄土中，随着磷肥的施用，两种苜蓿品种的根系周围羧酸浓度均下降，除了在10 mg P kg?1和20 mg P kg?1时，Longzhong的根系周围羧酸浓度显著高于Trifecta。草酸是两种品种中分泌最多的根系周围羧酸，其含量在Longzhong中为2.05–7.76 μmol g?1，而在Trifecta中为1.02–8.59 μmol g?1。草酸的含量显著高于柠檬酸和苹果酸。在Trifecta中，三种有机酸与SRL、pH和交换性铝含量显著正相关。而在Longzhong中，只有草酸和苹果酸与pH显著正相关。

在黄土中，随着磷供应量的增加，两种苜蓿品种的根系周围羧酸浓度呈现先增加后减少的趋势，峰值出现在40 mg P kg?1和20 mg P kg?1时。这表明，我们的第二个假设——植物在低磷供应条件下会分泌更多羧酸到根系周围——部分得到支持。苜蓿在低磷和低水分条件下释放更多的根系周围羧酸，以获取土壤中的磷。同时，根系周围羧酸的分泌量与土壤类型和pH值密切相关。在石灰土中，随着磷供应量的增加，根系周围pH值逐渐下降，而在黄土中，根系周围pH值在20 mg P kg?1时显著降低。

在石灰土中，随着磷供应量的增加，两种苜蓿品种的根系铝含量和土壤交换性铝含量均显著下降，但在20 mg P kg?1时达到最低值，而在对照组时达到最高值。根系铝含量与植物干重呈显著负相关。在黄土中，根系铝含量和土壤交换性铝含量在磷供应量增加时呈现相反的趋势，先下降后上升。根系铝含量与植物高度、茎粗、地上部分干重、根长、根表面积、根体积、根干质量（RDM）和根系质量比（RMR）呈显著负相关。

研究还发现，磷供应显著影响根系铝吸收和土壤交换性铝含量。在石灰土中，两种苜蓿品种的根系铝含量随着磷供应量的增加而逐渐下降，并在磷供应量超过40 mg P kg?1时显著增加。在黄土中，根系铝含量在磷供应量增加时呈现类似趋势。然而，随着磷供应量的增加，根系和地上部分的性状表现出下降趋势，而土壤交换性铝和根系铝含量则开始上升。磷对铝毒性的缓解效果因植物种类而异，某些植物如高粱对磷敏感，而其他如玉米则表现出更高的耐铝性。研究中，随着磷供应量的增加，土壤pH逐渐下降，导致更多的铝从土壤矿物中解吸到土壤溶液中，从而增加交换性铝和根系铝含量，这可能是地上部分和根系生长下降的原因。

本研究发现，磷供应对植物生长、根系形态和生理参数的影响因土壤类型和基因型而异。在石灰土中，Trifecta的植物高度、茎粗和地上部分干重随磷供应量的增加而显著提升，但在超过40 mg P kg?1时，这些性状的变化趋于稳定。黄土中，Trifecta和Longzhong的地上部分和根系性状在磷供应量达到20 mg P kg?1和40 mg P kg?1时分别达到峰值。这表明，在酸性土壤中，磷供应量的增加会提高植物干重，但超过一定阈值后，磷的积累会受到抑制，从而影响植物生长。研究还发现，耐铝型苜蓿（Trifecta）的磷吸收和利用效率高于敏感型（Longzhong），这可能与其根系形态和生理机制有关。此外，研究中未观察到明显的磷中毒症状，如叶片坏死或黄化，这表明磷利用效率的变化可能与微妙的代谢反馈和适应性调节有关，而非急性毒性。

研究进一步探讨了根系周围羧酸与土壤磷吸收之间的关系。根系周围羧酸的分泌是植物在磷缺乏土壤中获取磷的关键生理策略。在磷供应不足时，许多植物包括苜蓿会增加根系周围羧酸的分泌，以促进磷的释放。然而，在本研究中，石灰土中Trifecta和Longzhong的根系周围羧酸含量在对照组中最高，而在磷供应组中显著降低。这表明，当土壤磷供应充足时，植物可能减少根系周围羧酸的分泌，以降低不必要的能量消耗。在黄土中，两种苜蓿品种的根系周围羧酸含量在磷供应量为40 mg P kg?1和20 mg P kg?1时达到峰值，这说明根系周围羧酸的分泌与土壤类型和pH值密切相关。

本研究还探讨了铝-磷相互作用对植物的影响。在酸性土壤中，铝毒性和磷缺乏是影响作物产量的主要因素。传统上，磷的施用被认为是缓解铝毒性的有效方法。然而，研究发现，随着磷供应量的增加，植物的干重、高度、茎粗、根长、根表面积和根体积先增加后减少。这可能与磷的代谢过程和植物的适应性调节有关。在黄土中，两种苜蓿品种的根系周围羧酸分泌呈现出类似趋势，且在低磷供应条件下分泌更多，这可能有助于根系在酸性土壤中更有效地获取磷。同时，随着磷供应量的增加，土壤pH逐渐下降，导致更多的铝从土壤矿物中解吸到土壤溶液中，从而增加交换性铝和根系铝含量，这可能进一步抑制植物生长。

研究还发现，根系铝含量与植物干重呈显著负相关，这表明铝毒性的增加会直接抑制植物的生长。在黄土中，根系铝含量与植物高度、茎粗、地上部分干重、根长、根表面积、根体积、根干质量和根系质量比均呈显著负相关。这说明，铝毒性的增加会显著影响植物的生长表现，特别是在磷供应量较高的情况下，这种影响更为明显。

此外，研究还发现，磷供应对根系周围羧酸的分泌和土壤pH的影响因土壤类型和基因型而异。在石灰土中，随着磷供应量的增加，根系周围羧酸浓度显著下降，这可能与根系形态和生理适应性有关。而在黄土中，根系周围羧酸浓度先增加后减少，这可能与土壤pH的变化有关。草酸在两种土壤中均是主要的根系周围羧酸，其分泌量与磷吸收和利用效率呈显著正相关。柠檬酸和苹果酸的分泌量也受到磷供应量的影响，但在某些情况下不如草酸显著。这表明，植物在不同土壤条件下调整其根系周围羧酸的分泌策略，以优化磷的获取效率。

本研究的结果对于酸性土壤地区的苜蓿种植具有重要意义。首先，研究确定了不同苜蓿品种在不同土壤类型中的最佳磷供应量。其次，研究揭示了磷供应对植物生长、根系形态和生理参数的影响机制。此外，研究还探讨了根系周围羧酸的分泌与土壤磷吸收之间的关系，以及铝-磷相互作用对植物生长的潜在影响。这些发现不仅有助于优化磷肥施用策略，还为耐酸铝苜蓿品种的选育提供了理论依据。未来，还需要在田间条件下进行进一步的试验，以验证最佳磷供应量，并评估磷淋失对苜蓿生长的潜在影响。