《Green Analytical Chemistry》：Green metrics and Quality by Design tool evaluated UPLC content determination method for Sparsentan in formulation sample
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Sparsentan (SRN) 是一种内皮素和血管紧张素II受体拮抗剂，用于降低快速疾病进展风险的成人原发性免疫球蛋白A肾病患者的蛋白尿。在本研究中，研究人员使用反相超高效液相色谱 (reverse phase-UPLC) 技术开发并验证了一种测定药物制剂中
Sparsentan (SRN) 是一种内皮素和血管紧张素II受体拮抗剂，用于降低快速疾病进展风险的成人原发性免疫球蛋白A肾病患者的蛋白尿。在本研究中，研究人员使用反相超高效液相色谱 (reverse phase-UPLC) 技术开发并验证了一种测定药物制剂中SRN的方法。方法特异性在ACQUITY UPLC BEH C18分析色谱柱 [1.7 μm, 2.1 mm X 150 mm] 上实现，使用0.1%三氟乙酸 (Trifluoroacetic acid, pH 4.0) 和甲醇 (Methanol) 以65:35 v/v的比例作为流动相。流速为0.3 mL/min。柱温为42°C，样品室温度为5°C。进样体积为1 μL，检测波长为263 nm (UV)，总运行时间为3.0分钟。该方法在定量限 (LOQ) 至150%浓度水平内呈线性，相关系数为0.9995。回收率在50%至150%浓度水平进行，平均回收率为99.19%至100.54%。方法精密度数据结果为0.3%。样品在酸解、氧化、热解和光解条件下进行强制降解。使用质量源于设计 (Quality by Design, QbD) 工具研究方法的稳健性。降解和验证研究结果表明确立其稳定性。该方法根据国际人用药品技术要求协调理事会 (ICH) 指南进行验证，具有专属性、线性、耐用性、稳健性和准确性。使用先进绿色度量指标GAPI、NEMI、Eco-scale和AGREE研究了方法的绿色度。
以下是根据论文内容撰写的解读文章：
**研究背景与问题**
Sparsentan (SRN) 是一种新型口服双效拮抗剂，同时作用于内皮素A型受体 (ETAR) 和血管紧张素II 1型受体 (AT1R)，于2023年2月获得美国食品药品监督管理局 (FDA) 加速批准，用于降低原发性免疫球蛋白A肾病 (IgA nephropathy) 患者的蛋白尿。目前，尚无任何药典收录SRN原料药或制剂的官方专论。文献调研发现，已报道的两种反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 方法中，Haritha gali等人报道的方法运行时间为5分钟，且未采用任何方法评估工具（如QbD或绿色化学工具）来证明方法有效性；Siva Krishna等人报道的方法运行时间为6分钟，同样未使用此类评估工具。因此，研究人员旨在开发一种更高效、更环保的分析方法，利用超高效液相色谱 (UPLC) 技术缩短运行时间，并采用质量源于设计 (QbD) 和绿色度量工具系统评估方法的稳健性与环境友好性。
**研究人员开展的研究与结论**
研究人员开发并验证了一种基于反相UPLC的SRN含量测定方法，用于制剂样品。该方法采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，以0.1%三氟乙酸 (pH 4.0) 和甲醇 (65:35, v/v) 为流动相，流速0.3 mL/min，检测波长263 nm，总运行时间3.0分钟。方法学验证遵循ICH指南，结果显示：线性范围从定量限 (LOQ)至150%浓度水平，相关系数r=0.9995；回收率在99.19%–100.54%之间；方法精密度 (%RSD) 为0.3%。强制降解研究表明，SRN在酸、过氧化氢和光解条件下显著降解，在碱、热和中性条件下稳定。研究人员使用QbD基于实验设计 (DoE) 的统计工具评估了方法稳健性，确认有机比例、流速和柱温等关键方法参数 (CMPs) 的微小变化不影响色谱性能。同时，采用四种绿色度量指标——NEMI、Eco-scale、GAPI和AGREE评估方法绿色度，Eco-scale得分为77，AGREE得分为0.64，确认该方法为环境友好型。
**重要意义**
该研究首次将UPLC技术、QbD工具和多重绿色度量指标系统整合应用于SRN的含量测定，提供了一种快速、环保、稳健且指示稳定性的分析方法。该方法可推广至常规稳定性研究和质量控制分析，有助于满足制药行业对高效绿色分析技术的需求。论文发表在《Green Analytical Chemistry》。
**主要关键技术方法**
1. **UPLC（超高效液相色谱）技术**：采用ACQUITY UPLC系统，配备ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 (1.7 μm, 2.1 mm X 150 mm)，在等度洗脱模式下以0.1%三氟乙酸 (pH 4.0) 和甲醇 (65:35 v/v) 为流动相，流速0.3 mL/min，检测波长263 nm，总运行时间3.0分钟。
2. **QbD（质量源于设计）与DoE（实验设计）统计工具**：利用Design-Expert软件，采用两水平随机全因子设计，考察流速、有机比例和柱温三个因素对保留时间、拖尾因子和理论塔板数的影响，通过方差分析 (ANOVA) 评估模型显著性，确定设计空间并验证方法稳健性。
3. **强制降解研究**：按照ICH Q1A和Q1B指南，对SRN样品进行酸解 (2N HCl, 60°C/30分钟)、碱解 (2N NaOH, 60°C/30分钟)、氧化 (20% H
2O
2, 60°C/30分钟)、热降解 (105°C/6小时)、光降解 (1.2百万Lux·小时和200瓦时/平方米) 和中性水解 (60°C回流) 实验，评估方法的稳定性指示能力。
4. **绿色度量评估工具**：采用四种度量指标——NEMI（评估持久性、生物累积性、毒性、废物、危险性和腐蚀性）、Eco-scale（基于罚分系统）、GAPI（通过象形图评估样品采集、制备、技术和测定全过程）和AGREE（基于12条绿色分析化学原则的圆形图评分）综合评价方法的绿色度。
**研究结果**
**3.1. 方法开发**：通过六次试验优化色谱条件，最终确定使用0.1%三氟乙酸和甲醇 (65:35 v/v) 为流动相，流速0.3 mL/min，柱温42°C，SRN在1.3分钟洗脱，峰形对称，理论塔板数满足要求。
**3.2. 方法验证**：按照ICH指南，验证系统适用性、专属性、灵敏度、准确度、精密度、线性、范围和稳健性。系统适用性结果显示，六次重复进样的峰面积%RSD为0.3%，理论塔板数3996.6，拖尾因子1.1。
**3.3. 系统适用性**：评估通过六次标准溶液重复进样，峰不对称度、理论塔板数和主峰面积%RSD符合美国药典 (USP) 推荐标准。
**3.4. 专属性与强制降解研究**：空白、安慰剂和样品色谱图在SRN主峰保留时间无干扰。强制降解研究显示，在酸性、过氧化氢和光解条件下SRN显著降解（降解率分别为7.29%、8.64%和5.63%），而在碱性、热和中性水解条件下稳定。所有降解条件下的纯度角均小于纯度阈值，质量平衡在99.3%–99.7%之间，证明方法专属性强。
**3.5. 线性**：在10 μg/mL至60 μg/mL浓度范围内，SRN的校准曲线相关系数为0.9995，证明方法线性良好。
**3.6. LOD和LOQ**：通过校准曲线计算，检测限 (LOD) 为0.16 ppm，定量限 (LOQ) 为0.49 ppm。
**3.7. 精密度与中间精密度**：系统精密度（六次重复进样）%RSD为0.3%；方法精密度（六份不同样品制备）%RSD为0.4%；中间精密度（不同天、不同设备）总体%RSD为0.3%，证明方法精密且耐用。
**3.8. 准确度**：通过标准加入法在50%、100%和150%水平进行回收率实验，SRN的平均回收率在99.19%至100.54%之间，%RSD小于1.0，证明方法准确。
**3.9. 溶液稳定性**：样品在25°C和2–8°C下储存24小时和48小时，与新鲜制备样品相比，峰面积差异小于1.2%，表明SRN溶液在两种温度下48小时内稳定。
**3.10. 稳健性**：通过QbD和DoE统计分析，系统改变流速、有机比例和柱温，所有实验条件下的保留时间、拖尾因子和理论塔板数均满足USP标准。ANOVA分析显示模型显著（p<0.05），失拟项不显著，预测R2与实测R2差异小于0.2，证明方法稳健。
**总结讨论与结论**
讨论部分指出，强制降解研究中SRN在氧化、酸性和光解条件下产生两种潜在杂质，而在碱、热和中性条件下保持稳定。方法绿色度通过NEMI、Eco-scale、GAPI和AGREE四种度量指标综合评估，Eco-scale得分77（属于“优秀环境友好”区域），AGREE得分0.64，NEMI象形图显示三个绿色象限（PBT、危险化学品、腐蚀性试剂），仅废物象限为红色（因溶剂消耗超过50 g/分析），GAPI象形图进一步确认方法在样品制备和测定环节的环境影响较低。QbD统计工具证实该方法具有耐久性和适应性。
**研究结论**：实验与验证结果确认，所开发的方法能够通过合适的固定相和流动相对SRN进行定量。该方法已根据ICH Q2指南进行验证。研究人员在氧化、光解和酸性样品降解过程中发现两种潜在杂质。SRN在过氧化氢、酸性和光解降解条件下易受影响，但在碱性、热和中性环境条件下保持稳定。该方法的绿色度通过分析Eco-scale、NEMI、GAPI和AGREE四个不同度量指标进行了深入研究和验证。通过QbD与DoE统计工具评估了方法的强度，发现该技术具有耐久性和适应性。这些度量指标共同确认了该方法的生态友好性，巩固了其作为可持续方法的声誉。降解和验证研究表明，该方法具有专属性、线性、准确性、精密性、稳健性和稳定性指示能力，可用于药物制剂剂型中SRN的估测。
