基于香豆素的光敏固态载体有助于非色谱法纯化RNA寡核苷酸

《The Journal of Organic Chemistry》：Coumarin-Based Photolabile Solid Support Facilitates Nonchromatographic Purification of RNA Oligonucleotides

基于邻苯二甲酰亚胺的可见光光解锚固剂合成及其在RNA寡核苷酸非色谱纯化中的应用。该锚固剂通过456 nm可见光光解实现RNA固相合成产物的选择性释放，特别适用于含硫代磷酸骨架的RNA，避免紫外线导致的RNA结构损伤。优化后流程成功纯化20-nt至103-nt长链RNA，包括sgRNA，其功能经CRISPR-Cas9实验验证与常规纯化方法相当，且纯度达86.2%-97.4%。

　　RNA研究近年来取得了显著进展，尤其是在生物医学领域，RNA的应用范围不断扩大，从基础的基因表达调控到疾病治疗和基因编辑技术，RNA都扮演着至关重要的角色。随着RNA药物的不断开发，例如siRNA类药物patisiran（2018年获批）、givosiran（2019年）、lumasiran（2020年）以及inclisiran（2022年），对RNA合成和纯化技术的需求也日益增长。这些药物的活性成分通常通过传统的固相合成方法制备，并借助高效液相色谱（HPLC）进行纯化。然而，对于长度较长且结构复杂的RNA分子，如用于CRISPR-Cas9系统的单导RNA（sgRNA），传统的HPLC纯化方法存在一定的局限性，尤其是在处理含有磷硫键（phosphorothioate）的RNA时，紫外光可能导致结构损伤，从而影响其功能。

针对这些问题，研究人员开发了一种基于香豆素的光裂解锚定系统，用于固相合成和非色谱纯化RNA寡核苷酸。该方法的优势在于其光裂解过程使用可见光（波长为456 nm），这与传统使用紫外光的硝基芳基锚定系统相比，具有更高的兼容性，尤其是在处理含有磷硫键的RNA时，可以避免因紫外光引起的结构破坏。同时，这种方法简化了纯化流程，减少了对昂贵设备和色谱柱的依赖，使得RNA的合成与纯化更加高效和经济。

在本研究中，科学家们首先通过合成一个20个核苷酸的聚尿嘧啶RNA（RNA1）作为模型，优化了该光裂解锚定系统的合成与纯化步骤。通过使用Kessil灯进行456 nm可见光照射，成功实现了RNA的裂解，并在裂解后利用带有三唑啉（TCO）基团的固相支持材料进行捕获。实验结果表明，经过30分钟的光裂解处理，RNA1的纯度达到了86.2%，并且其质量通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）得到了验证，质量与理论值高度一致。此外，使用可见光进行裂解的效率也与传统的胺甲酸乙酯（AMA）处理相当，这说明该方法在关键步骤上具有可行性。

为了进一步验证该方法的普适性，研究团队还将其应用于结构化和非结构化的RNA分子，包括含有磷硫键的RNA（RNA4和RNA5）以及一个103个核苷酸的sgRNA。结果显示，即使在含有磷硫键的RNA中，该方法也能实现较高的纯度，分别为97.4%和97.2%。对于103个核苷酸的sgRNA，尽管其长度和结构复杂，但通过非色谱纯化方法仍然能够获得功能正常的RNA分子，并通过CRISPR-Cas9实验验证了其切割效率。实验结果表明，实验性纯化的sgRNA与标准纯化方法获得的sgRNA在切割效率上几乎一致，达到了95%左右的DNA切割效率，证明了该方法在实际应用中的有效性。

该研究不仅提供了一种新的RNA合成与纯化策略，还解决了传统方法在处理长链RNA和含磷硫键RNA时的局限性。通过使用可见光而非紫外光进行裂解，有效避免了对RNA分子结构的潜在破坏，从而提高了其在体内的稳定性和功能完整性。此外，非色谱纯化方法简化了操作流程，降低了实验成本，使得RNA的合成和纯化更加高效和环保。

然而，该方法仍然存在一些需要改进的地方。例如，目前的非色谱纯化过程无法兼容含有5′端修饰的RNA分子，如带有磷酸基团的RNA。因此，未来的研究方向之一是探索新的固相支持材料，以实现对这类RNA分子的捕获。此外，虽然该方法在纯度方面表现良好，但仍有进一步优化的空间，尤其是在标记和捕获步骤中提高效率。通过使用更具反应性的三唑啉（Tz）和三唑啉酮（TCO）化合物，有望提高RNA的纯度和产量。

综上所述，基于香豆素的光裂解锚定系统为RNA合成和纯化提供了一种新的解决方案，尤其适用于需要避免紫外光损伤的RNA分子。该方法不仅提高了RNA的纯度和功能完整性，还简化了纯化流程，降低了对昂贵设备和色谱柱的依赖，为未来的RNA药物开发和基因编辑技术提供了重要的技术支持。随着研究的深入和技术的不断完善，这种非色谱纯化方法有望在生物医学领域发挥更大的作用，推动RNA技术的发展和应用。