人参皂苷Rh2靶向PIN1抑制非小细胞肺癌干细胞样表型并增强吉非替尼疗效的新机制

《Journal of Translational Medicine》：Ginsenoside Rh2 as a novel PIN1 inhibitor disrupting the cancer stem cell-like phenotype in non-small cell lung cancer

本研究针对非小细胞肺癌(NSCLC)治疗耐药和转移难题，发现人参皂苷Rh2(G-Rh2)可作为新型PIN1抑制剂，通过破坏PIN1/PGK1相互作用，抑制PGK1线粒体转位，逆转有氧糖酵解，从而抑制癌症干细胞(CSCs)特性、上皮-间质转化(EMT)和转移，并显著增强吉非替尼(GF)敏感性。该研究为克服NSCLC耐药提供了新靶点和联合治疗策略。

　　

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占绝大多数。尽管分子靶向治疗和免疫疗法取得了显著进展，但大多数晚期NSCLC患者最终会对现有治疗方案产生耐药性，导致疾病持续进展。癌症干细胞(CSCs)被认为是肿瘤 initiation、维持、转移和耐药的关键驱动因素。这些细胞具有自我更新和多向分化潜能，能够分化成不同种类和程度的癌细胞。上皮-间质转化(EMT)过程与CSCs特性密切相关，其标志是E-钙黏蛋白(E-cad)下调和N-钙黏蛋白(N-cad)上调，促进细胞迁移和侵袭。因此，靶向CSCs成为增强化疗敏感性、抑制肿瘤生长和转移的有前景策略。

人参作为传统中药的重要组成部分，其活性成分人参皂苷具有多种药理作用。其中，稀有人参皂苷Rh2(G-Rh2)显示出广谱抗肿瘤活性。然而，G-Rh2的确切分子靶点及其调节CSCs介导的恶性进展的机制尚不清楚。为了解决这些问题，研究人员在《Journal of Translational Medicine》上发表了题为"Ginsenoside Rh2 as a novel PIN1 inhibitor disrupting the cancer stem cell-like phenotype in non-small cell lung cancer"的研究论文。

为阐明G-Rh2的抗NSCLC机制，研究人员采用了一系列关键技术方法：利用蛋白质微阵列筛选G-Rh2结合蛋白；通过分子对接、Co-IP(co-immunoprecipitation)和酶活性测定验证靶点相互作用；使用肿瘤球形成实验、流式细胞术和RT-qPCR(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction)评估CSCs特性；通过Transwell和伤口愈合实验分析细胞迁移和侵袭；采用Western blotting检测蛋白表达；利用代谢物检测分析葡萄糖摄取、乳酸和丙酮酸产生；通过线粒体蛋白提取和免疫荧光观察蛋白亚细胞定位；并建立异种移植瘤和原位肺癌小鼠模型进行体内疗效验证。

G-Rh2抑制NSCLC干细胞样细胞特性

研究发现G-Rh2处理显著降低了A549细胞的肿瘤球形成能力和大小。流式细胞术分析显示，G-Rh2处理后干细胞标志物CD44和CD133的表达显著降低。Western blotting和RT-qPCR结果进一步证实，G-Rh2处理抑制了关键干细胞相关基因SOX2、OCT4和NANOG在转录和翻译水平的表达。这些结果表明G-Rh2通过抑制肿瘤干细胞样特性来抑制NSCLC细胞增殖。

G-Rh2通过减少干细胞样细胞比例抑制NSCLC转移和EMT

Transwell迁移和伤口愈合实验结果表明，G-Rh2显著抑制了A549细胞的侵袭和迁移能力。Western blotting分析显示，G-Rh2处理导致E-cad表达上调，而N-cad和Vimentin表达显著下调，表明G-Rh2抑制了EMT的异常激活。这些结果提示G-Rh2通过减少肿瘤干细胞样细胞比例来抑制NSCLC转移和迁移。

G-Rh2增强NSCLC细胞对GF治疗的敏感性

研究人员将低剂量G-Rh2与DDP(顺铂)或GF(吉非替尼)联合给药，评估A549细胞的增殖能力。结果显示G-Rh2增强了这两种药物的抗肿瘤效果，其中G-Rh2与GF联用显示出更明显的协同效应。流式细胞术分析进一步表明，G-Rh2与GF联合处理显著增加了A549细胞的凋亡率。这些结果提示G-Rh2通过减少CSCs样亚群和调节凋亡通路来增强NSCLC细胞对GF的敏感性。

蛋白质微阵列确认G-Rh2与PIN1的相互作用

通过蛋白质微阵列筛选，研究人员发现G-Rh2与PIN1(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1)具有强结合亲和力。分子对接模拟显示G-Rh2与PIN1在Gln131、Ser114和Gln129残基处有强相互作用。进一步实验证实G-Rh2通过泛素-蛋白酶体途径促进PIN1降解，并显著抑制PIN1酶活性。PIN1过表达逆转了G-Rh2处理诱导的EMT变化，表明G-Rh2通过结合并诱导PIN1降解来发挥抗肿瘤作用。

G-Rh2抑制PIN1依赖的PGK1线粒体转位

研究发现G-Rh2处理显著抑制了A549细胞的葡萄糖摄取、乳酸产生和丙酮酸生成，同时增强了PDH(pyruvate dehydrogenase)活性。但在PIN1敲低后，G-Rh2对这些代谢参数的调节作用被取消，表明G-Rh2对糖酵解的调节是PIN1依赖性的。Co-IP实验显示G-Rh2处理破坏了PIN1与PGK1(phosphoglycerate kinase 1)的结合，减少了PGK1与线粒体膜蛋白TOM20和TIM22的关联。免疫荧光和Western blotting分析进一步证实G-Rh2处理显著降低了PGK1的线粒体定位。此外，G-Rh2处理抑制了PDHK1(pyruvate dehydrogenase kinase 1)的磷酸化和PDH的表达。引入PGK1 S203A突变体后，G-Rh2不再抑制PGK1的线粒体转位，其对PDHK1和PDH磷酸化的影响也消失。

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G-Rh2通过调节PIN1/PGK1通路抑制肿瘤转移并增强治疗疗效

使用PIN1抑制剂(API-1)、PGK1抑制剂(NG52)和PDHK1抑制剂(AZD7545)处理后，G-Rh2对A549细胞迁移和侵袭的调节作用被取消。同样，在抑制PIN1、PGK1或PDHK1后，G-Rh2对EMT的调节作用也消失。这些结果表明G-Rh2通过PIN1/PGK1通路抑制NSCLC转移。此外，在抑制PIN1、PGK1或PDHK1后，G-Rh2与DDP或GF联用对细胞凋亡和活力的影响微乎其微，表明G-Rh2依赖PIN1/PGK1通路增强NSCLC细胞的治疗敏感性。

G-Rh2通过降低干性并调节PIN1/PGK1通路抑制肿瘤生长

体内实验显示，G-Rh2处理显著降低了不同接种密度下的肿瘤形成率，表明G-Rh2在体内抑制CSCs比例。在肺转移小鼠模型中，G-Rh2处理显著减少了肺转移病灶数量。免疫组化分析进一步证实G-Rh2处理后E-cad和N-cad的表达模式与体外研究结果一致。此外，G-Rh2处理降低了CSCs标志物表达，并通过调节PIN1/PGK1通路抑制了PDHK1磷酸化并促进了PDH磷酸化。在皮下移植瘤模型中，G-Rh2与GF联合治疗显示出优于GF单药治疗的肿瘤生长抑制效果，且没有显著体重减轻。联合治疗还减少了癌细胞增殖、EMT并促进了凋亡。

本研究首次证实G-Rh2通过靶向PIN1/PGK1信号通路抑制NSCLC干细胞样表型和EMT过程，同时增强肿瘤细胞对GF治疗方案的敏感性。具体机制上，G-Rh2结合并促进PIN1降解，破坏PIN1与PGK1的相互作用，减少PIN1依赖的PGK1线粒体转位，进而抑制PDHK1 T338位点磷酸化，增强PDH活性，促进丙酮酸进入三羧酸循环，恢复线粒体氧化磷酸化，抑制肿瘤有氧糖酵解。

该研究的重大意义在于阐明了G-Rh2抗NSCLC作用的主要分子靶点和调控通路，为开发靶向PIN1的临床抗肿瘤疗法提供了新思路。作为人参的主要生物活性成分之一，G-Rh2具有广谱抗肿瘤活性且安全性较高，本研究为其作为辅助抗肿瘤策略的临床应用奠定了理论基础，也为筛选中药辅助抗肿瘤方案提供了临床前研究依据。通过靶向PIN1/PGK1轴，G-Rh2有效克服了NSCLC的耐药性和转移性，为改善晚期肺癌患者预后提供了有前景的治疗策略。