源自miR-26a-5p修饰的脂肪间充质干细胞的外泌体通过靶向MAP2K4来促进伤口愈合

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Exosomes derived from miR-26a-5p-modified adipose mesenchymal stem cells improve wound healing by targeting MAP2K4

异常伤口愈合影响身体功能并加重医疗负担。研究显示，脂肪间充质干细胞（AMSCs）衍生的外泌体通过miR-26a-5p调控MAP2K4信号通路，抑制IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子，促进胶原蛋白（Col1a1、Col2a1、Col3a1）合成和α-SMA表达，同时增强CD31介导的血管生成，从而加速皮肤伤口愈合。生物信息学分析鉴定了13个差异miRNA和143个靶基因，其中miR-26a-5p作为核心节点调控MAPK级联、cAMP、Wnt等信号通路。动物实验证实过表达miR-26a-5p的AMSCs外泌体疗效优于直接miRNA干预，为新型伤口修复策略提供了理论依据。

　　### 介绍

伤口愈合是一个复杂且动态的生理过程，从受伤后立即开始，持续数月甚至数年，直到伤口闭合。该过程包括多个阶段，如炎症反应、细胞增殖、血管生成以及细胞外基质（ECM）的重塑。在炎症阶段，身体通过清除病原体和坏死组织为后续修复奠定基础；在细胞增殖阶段，形成结缔组织和新生血管，为伤口填充和营养供应提供支持；而在重塑阶段，新形成的组织会逐渐恢复到接近正常组织的结构和功能。通常，伤口可分为急性和慢性伤口。急性伤口通常在可预测的时间内愈合，而慢性伤口则因细胞和分子功能的低效，常在6周内未能愈合，表现出显著的愈合障碍。如果得不到有效治疗，慢性伤口可能导致更高的发病率和医疗成本，甚至在严重情况下引发截肢。

目前，临床上促进伤口愈合的方法包括多种敷料、药物治疗（如抗生素和生长因子）、物理治疗（如负压伤口治疗和激光治疗）以及皮肤移植。尽管这些方法在某些情况下显示出一定的疗效，但它们在广泛应用方面受到药物耐受性、免疫排斥反应、复杂的给药方式和高昂成本等限制。因此，深入研究伤口愈合的机制，并开发更有效的治疗策略，对于再生医学领域至关重要。

间充质干细胞（MSCs）因其自我更新能力、多向分化潜能和旁分泌调控特性，在再生医学中扮演着重要角色。其中，脂肪间充质干细胞（AMSCs）因其易于分离、体外扩增和多能性，被认为是再生医学中的重要来源，包括组织修复和再生。然而，MSCs在伤口治疗中的应用仍受到存储困难、突变相关的肿瘤发生、最佳细胞活性、免疫排斥和伦理问题等限制。已有研究表明，AMSCs可通过自分泌和旁分泌途径激活一系列生物活性因子，从而参与皮肤损伤的修复过程。外泌体是一种由几乎所有细胞分泌的小型囊泡，尺寸约为30–150纳米，能够通过自分泌或旁分泌途径被细胞吸收，被认为是干细胞功效的主要贡献者。一些研究还发现，外泌体可以作为生物基因递送系统，其携带的miRNA具有较高的稳定性和抗RNA酶降解能力，从而在转录后水平调控基因表达。miRNA作为一种小的内源性RNA分子，长度约为22个核苷酸，已被证明在健康和疾病中发挥重要作用，包括多种癌症、心血管疾病和伤口愈合。

尽管miRNA在多种生理和病理过程中具有重要作用，但其在皮肤修复中的具体功能仍需进一步探索。在本研究中，我们利用GSE55661数据集，通过一系列生物信息学分析，识别出关键miRNA并构建了miRNA-mRNA调控网络。我们发现miR-26a-5p在该网络中扮演了核心节点的角色，其靶基因MAP2K4参与了多个与伤口愈合相关的通路，如MAPK级联反应、cAMP信号通路、relaxin信号通路、Hippo信号通路、Apelin信号通路、Wnt信号通路以及cGMP-PKG信号通路。因此，我们进一步验证了miR-26a-5p与MAP2K4的相互作用，并探讨了AMSCs来源的外泌体miR-26a-5p在伤口愈合中的作用及其潜在机制。

### 方法

#### 2.1 生物信息学分析

我们从NCBI GEO数据库下载了GSE55661数据集，该数据集包含18只小鼠皮肤组织样本的miRNA表达谱。测试平台为GPL18386 Luminex多物种miRNA芯片（miRBase 8.0）。随后，我们选择了6个样本，这些样本是在损伤后2天采集的，包括3个损伤部位样本和3个正常对照样本。使用R4.3.1版本的limma包，我们基于假发现率（FDR）<0.05和|log2倍数变化（FC）|>1的阈值，筛选出13个差异表达的miRNA（DEmiRNA）。这些DEmiRNA随后被提交至miRWalk 3.0数据库，以寻找其靶基因。我们保留了标记为“验证”的miRNA-mRNA配对，并利用Cytoscape 3.6.1进行可视化。接着，对网络中的靶基因进行了功能分析，包括基因本体（GO）的生物学过程（BP）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，筛选出具有显著富集意义的基因。

#### 2.2 双荧光素酶报告基因实验

为了验证miR-26a-5p与MAP2K4之间的相互作用，我们合成了MAP2K4 3'非翻译区（3'-UTR）的野生型和突变型序列，并使用pGL3-basic载体构建了相应的报告质粒（pGL3-MAP2K4-WT和pGL3-MAP2K4-MUT）。随后，我们将pGL3-basic载体（500 ng）、pGL3-MAP2K4-WT（500 ng）和pGL3-MAP2K4-MUT（500 ng）与miR-26a-5p模拟物（100 nM）或阴性对照模拟物（NC，100 nM）共转染至293T细胞中，转染过程遵循Lipofectamine 2000的制造商指南。转染6小时后，更换为完全培养基，并继续培养48小时。最后，收集细胞并使用双荧光素酶报告系统测定相对荧光素酶活性。

#### 2.3 细胞培养与转染

我们从Cyagen Biosciences Inc.购买了小鼠AMSCs，并在α-MEM培养基中培养，该培养基补充了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。通过Lipofectamine 2000按照制造商说明构建了miR-26a-5p过表达的AMSCs。具体而言，将AMSCs接种于24孔板中，密度为4 × 10^4，并在培养过夜后更换为无血清培养基，随后使用15 pmol miR-26a-5p agomir（GeneRay）或NC（GeneRay）进行转染。转染6小时后，更换为完全培养基，并继续培养48小时。提取总RNA后，使用实时定量PCR（RT-qPCR）检测miR-26a-5p水平，以评估细胞转染效率。

#### 2.4 AMSCs来源的外泌体分离与表征

我们从miR-26a-5p过表达的AMSCs和普通AMSCs中分离外泌体。分离过程在4°C下进行，首先将细胞上清液离心500 × g 5分钟，随后转移至新管中。再进行2000 × g离心30分钟，然后进行10,000 × g离心60分钟。离心后，将上清液通过0.22 μm无菌滤膜过滤，并收集至超高速离心管中。最后，在120,000 × g下离心70分钟，去除上清液，将沉淀物重悬于无菌PBS（200 μL），并将其储存在-80°C。

外泌体浓度通过BCA试剂盒测定，随后使用Nanosight NS300纳米颗粒分析仪（NTA）分析其粒径分布，方法参照Yang等（2021）。外泌体的形态和超微结构通过透射电子显微镜（TEM）观察，设备来自JEOL LTD。同时，使用Western blot检测外泌体特异性蛋白（CD63、CD81和HSP70）以及阴性对照蛋白（calnexin）的表达。

#### 2.5 动物实验

我们购买了24只特定病原体无（SPF）雄性C57BL/6小鼠，体重为20 ± 2克，来自上海斯莱克实验动物有限公司。所有小鼠在受控的温度（24°C ± 2°C）和湿度（50% ± 5%）条件下饲养，遵循12小时明暗循环。实验期间，小鼠自由获取标准实验室饲料和过滤水。所有动物实验均严格遵循Guoke Ningbo生命科学与健康产业研究院的动物伦理委员会（IACUC）的指南和规定（批准号：GX-2025-XM-0004），并由委员会审核批准以确保动物的伦理处理。

经过7天的适应期后，将小鼠随机分为四组（每组6只）：对照组、模型组、AMSCs-agomir-Exo组和miR-26a-5p agomir组。模型组、AMSCs-agomir-Exo组和miR-26a-5p agomir组的小鼠首先用于建立皮肤缺陷小鼠模型。具体而言，将小鼠深麻醉后固定于俯卧位，去除背部毛发并用75%酒精消毒。随后，创建一个直径为2厘米的全层皮肤缺损。在受伤后的第一天，模型组、AMSCs-agomir-Exo组和miR-26a-5p agomir组的小鼠分别注射PBS、miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体（200 μg/只）和miR-26a-5p agomir（20 nmol/只）。对照组未接受任何治疗。此外，我们还获得了12只C57BL/6小鼠，并将其随机分为两组（每组6只）：si-NC组和si-MAP2K4组。在受伤后的第一天，si-NC组和si-MAP2K4组的小鼠分别注射si-NC（20 nmol/只）和si-MAP2K4（20 nmol/只）。在治疗后第0、4、8和12天，分别拍摄各组小鼠的伤口并进行比较。使用2厘米×2厘米的统一视野，利用图像分析软件IPP 6.0分析伤口面积的变化。在治疗后的第12天，所有小鼠通过颈椎脱位处死，收集伤口和周围皮肤组织。部分组织用4%多聚甲醛固定，用于后续的组织病理学分析；其余部分用于进一步的RT-qPCR和Western blot分析。

#### 2.6 组织病理学分析

固定组织样本经过脱水、石蜡包埋，并切成4微米厚的切片。切片在60°C下烘烤30分钟，随后脱蜡和复水。对于苏木精-伊红（HE）染色，处理后的切片先用苏木精染色10分钟，再用伊红染色90秒。脱水、透明化和封片后，使用光学显微镜（Olympus Corporation）扫描并拍摄切片。

对于Masson染色，切片先用重铬酸钾作为媒染剂处理12小时，随后用Weigert铁苏木精染色10分钟。脱水后，用1%盐酸乙醇进行分化处理，然后用丽春红酸番红染色10分钟。接着，用磷钼酸处理150秒，再用氨基黑染色5分钟。用1%冰醋酸处理1分钟后，进行乙醇脱水，最后用中性树胶封片，并使用光学显微镜观察图像。

#### 2.7 实时定量PCR（RT-qPCR）

使用RNA提取溶液（Servicebio）提取总RNA，并按照制造商说明进行质量检测和定量。随后，将1微克总RNA逆转录为cDNA，使用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA合成试剂盒（TaKaRa）进行逆转录。所有引物序列见表1。

对于miR-26a-5p水平的检测，采用茎环RT-PCR方法，以U6作为内参基因。首先，制备10微升的变性混合物，用于miR-26a-5p的逆转录。随后，在20微升的总体积中，加入10微升的变性溶液、4微升的5× PrimeScript II缓冲液、0.5微升的RNase抑制剂（40 U/微升）、1微升的PrimeScript II逆转录酶（200 U/微升）和4.5微升的无RNase的蒸馏水。逆转录过程包括在42°C下孵育60分钟，随后在95°C下加热5分钟以失活酶。对于相关基因的表达水平，使用RT-qPCR检测，包括Map2k4、Col1a1、Col2a1、Col3a1、α-Sma、Tnf-α、Il1β和Il6。反应程序包括初始变性步骤在95°C下持续5分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95°C下10秒的变性步骤和60°C下30秒的退火步骤。最终，使用2^?ΔΔCT方法分析miR-26a-5p水平和相关基因的表达。

#### 2.8 蛋白质印迹（Western blotting）

使用RIPA（Beyotime Biotechnology）从组织样本或外泌体样本中提取总蛋白，并使用BCA试剂盒进行定量。总蛋白样品在10% SDS-PAGE（堆叠胶：60 V 30分钟；运行胶：110 V 120分钟）中分离，并转移到PVDF膜上（100 V 50分钟在冰上）。使用5%脱脂奶粉在37°C下孵育2小时进行封闭。随后，膜上孵育初级抗体，包括抗CD63抗体（1:1,000，Abclonal）、抗CD81抗体（1:1,000，Abclonal）、抗HSP70抗体（1:1,000，Proteintech）、抗calnexin抗体（1:1,000，Proteintech）、抗MAP2K4抗体（1:1,000，Proteintech）、抗COL1A1抗体（1:1,000，NOVUS）、抗α-SMA抗体（1:1,000，Cell Signaling Technology）、抗TNF-α抗体（1:1,000，Cell Signaling Technology）和抗GAPDH抗体（1:10,000，Proteintech）。孵育过夜后，膜上孵育次级抗体（（H + L）-HRP山羊抗兔/抗鼠IgG），在37°C下孵育2小时。洗膜后，使用Millipore ECL试剂盒（Beyotime Biotechnology）进行蛋白带显影，并使用上海天能科技有限公司的系统进行拍摄。

#### 2.9 统计分析

每个实验重复三次，数据以均值±标准差表示。统计分析使用SPSS软件进行，所有图表使用GraphPad Prism 9（GraphPad软件，San Diego, CA）绘制。在分析前，对所有数据进行方差齐性检验，计算P值。对于两个独立组之间的比较，使用独立样本t检验；对于多个组之间的比较，若P值>0.05，采用单因素方差分析（ANOVA）并结合最小显著差（LSD）进行多重比较；若P值≤0.05，采用ANOVA并结合Dunnett T3进行多重比较。统计显著性设置为P值小于0.05。

### 结果

#### 3.1 DEmiRNAs的鉴定及其功能分析

根据FDR <0.05和|log2FC| >1的阈值，我们在损伤组织样本和正常对照样本之间筛选出13个差异表达的miRNA（DEmiRNA），包括miR-424、miR-20b、miR-101b、miR-30c、miR-185、miR-30d、miR-26a、miR-133a、miR-26b、miR-1、miR-29a、miR-223和miR-202（见表2）。随后，将这些DEmiRNA提交至miRWalk 3.0数据库，寻找其靶基因。我们识别出149个标记为“验证”的miRNA-mRNA调控对，并构建了一个由12个DEmiRNA和143个调控靶基因组成的miRNA-mRNA调控网络（见图1A）。在该网络中，miR-26a在损伤组织中表达下调，因此被选为后续实验的核心靶点。

表2列出了损伤样本与正常对照样本之间的差异表达miRNA（DEmiRNA）。

图1展示了miRNA-mRNA调控网络的构建及其基因功能分析。图1A显示了由12个差异表达miRNA和143个调控靶基因组成的调控网络，其中miR-26a作为核心节点。图1B展示了网络中基因在生物学过程中的显著富集项，包括“MAPK级联反应”、“转录核糖核酸聚合酶II的调控”、“多细胞生物体的发育”、“神经元分化”、“经典Wnt信号通路的负调控”、“软骨细胞分化”和“干细胞增殖”。图1C展示了靶基因在KEGG通路中的显著富集项，包括“cAMP信号通路”、“relaxin信号通路”、“Hippo信号通路”、“Apelin信号通路”、“Wnt信号通路”、“cGMP-PKG信号通路”和“谷氨酸能突触”。

#### 3.2 miR-26a-5p与MAP2K4的相互作用

根据所构建的miRNA-mRNA调控网络，我们发现miR-26a与MAP2K4相互作用，并且MAP2K4在MAPK级联反应、relaxin信号通路和生长激素的合成、分泌和作用中起着重要作用。因此，我们进行了双荧光素酶报告基因实验以确认miR-26a-5p与MAP2K4之间的关系。在pGL3-basic质粒中，NC模拟物和miR-26a-5p模拟物的相对荧光素酶活性没有显著差异（P > 0.05，见图2A）。然而，在pGL3-MAP2K4-WT质粒中，miR-26a-5p模拟物转染后的相对荧光素酶活性明显低于NC模拟物转染后的活性（P < 0.05，见图2A）。当MAP2K4被突变（pGL3-MAP2K4-MUT质粒）后，miR-26a-5p模拟物转染后的相对荧光素酶活性明显高于pGL3-MAP2K4-WT质粒转染后的活性（P < 0.05，见图2A）。这些结果表明，MAP2K4是miR-26a-5p的靶基因。

#### 3.3 细胞转染效率与外泌体表征

为了探讨AMSCs来源的外泌体miR-26a-5p对伤口愈合的影响，我们构建了miR-26a-5p过表达的AMSCs，并分离外泌体。结果显示，miR-26a-5p在AMSCs和miR-26a-5p过表达的AMSCs中的表达水平分别为1.00 ± 0.09和391.51 ± 16.22，表明miR-26a-5p在miR-26a-5p过表达的AMSCs中显著上调（P < 0.05，见图2B）。这些结果表明，miR-26a-5p过表达的AMSCs成功构建，并可用于后续的外泌体分离。

随后，我们从AMSCs和miR-26a-5p过表达的AMSCs中分离外泌体，并通过NTA、TEM和Western blot进行表征。NTA结果显示，AMSCs来源的外泌体和miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体的主要峰分别为96.5纳米和109纳米，其平均粒径分别为147.4纳米和151.5纳米（见图2C）。结果与外泌体的粒径分布一致（Krylova和Feng，2023）。TEM图像显示，AMSCs来源的外泌体和miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体呈现近似圆形或杯状形态，直径约为100纳米（见图2D）。Western blot分析表明，外泌体特异性标记物CD63、CD81和HSP70在两种外泌体和细胞中均有表达，而阴性对照蛋白calnexin仅在细胞中表达（见图2E）。最后，我们检测了AMSCs来源的外泌体和miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体中miR-26a-5p的水平。结果显示，miR-26a-5p在miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体中显著上调（P < 0.05，见图2F）。这些结果表明，miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体成功分离，并可用于后续的动物实验。

#### 3.4 miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体对小鼠伤口愈合的影响

为了进一步探讨miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体对小鼠伤口愈合的影响，我们创建了直径为2厘米的全层皮肤缺损模型，并将小鼠随机分配至miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体和miR-26a-5p agomir治疗组。在治疗后的第0、4、8和12天，我们拍摄了各组小鼠的伤口图像。如图3A所示，随着时间的推移，伤口逐渐愈合，且在第12天，AMSCs-agomir-Exo组和miR-26a-5p agomir组的伤口愈合效果较好。在第12天，AMSCs-agomir-Exo组和miR-26a-5p agomir组的伤口愈合率显著高于模型组（P < 0.05），并且AMSCs-agomir-Exo组的愈合率明显高于miR-26a-5p agomir组（P < 0.05，见图3A）。随后，我们使用HE染色和Masson染色观察了不同组别小鼠的皮肤损伤情况。结果显示，对照组小鼠的组织正常，而模型组小鼠的组织出现炎症细胞浸润和胶原沉积（见图3B）。然而，在miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体或miR-26a-5p agomir治疗后，小鼠的伤口愈合更快，炎症细胞浸润减少，胶原沉积较少，且胶原结构更薄且有序（见图3B）。此外，我们检测了miR-26a-5p的水平，发现其在模型组小鼠中显著低于对照组（P < 0.05）。然而，在miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体和miR-26a-5p agomir治疗后，miR-26a-5p的水平显著提高（P < 0.05，见图3C）。这些结果表明，AMSCs来源的外泌体miR-26a-5p能够促进伤口愈合。

#### 3.5 RT-qPCR和Western blot分析

为了进一步揭示AMSCs来源的外泌体miR-26a-5p促进伤口愈合的潜在分子机制，我们使用RT-qPCR和Western blot检测了相关基因和蛋白的表达。与对照组相比，模型组小鼠的MAP2K4表达显著上调（P < 0.05）。然而，在miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体和miR-26a-5p agomir治疗后，MAP2K4的表达显著下调（P < 0.05，见图4）。对于Col1a1、Col2a1和Col3a1的表达，我们发现Col1a1和Col3a1在模型组中显著下调，而Col2a1显著上调（P < 0.05）。然而，在miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体和miR-26a-5p agomir治疗后，Col1a1、Col2a1和Col3a1的表达显著上调（P < 0.05，见图4）。对于CD31和α-SMA的表达，我们发现模型组小鼠的表达显著低于对照组（P < 0.05），但在miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体和miR-26a-5p agomir治疗后，它们的表达显著上调（P < 0.05，见图4）。随后，我们检测了miR-26a-5p在不同组别小鼠皮肤组织中的水平。结果显示，miR-26a-5p在miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体和miR-26a-5p agomir治疗组中显著上调（P < 0.05，见图4）。这些结果表明，miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体能够有效促进伤口愈合。

#### 3.6 MAP2K4在小鼠伤口愈合中的作用及潜在机制

此外，我们还探讨了MAP2K4在小鼠伤口愈合中的作用及其潜在机制。如图6A所示，随着天数的增加，si-NC组和si-MAP2K4组小鼠的伤口逐渐愈合。定量分析显示，在第4天，si-NC组和si-MAP2K4组的伤口愈合率没有显著差异（P > 0.05）；但在第8天和第12天，si-MAP2K4组的伤口愈合率显著高于si-NC组（P < 0.05），且在第12天时，si-MAP2K4组的愈合效果最佳（见图6B）。RT-qPCR结果显示，与si-NC组相比，si-MAP2K4组的MAP2K4和TNF-α的mRNA表达显著下调（P < 0.05）；而Col1a1和α-SMA的mRNA表达显著上调（P < 0.05，见图6C）。对于miR-26a-5p，其在si-MAP2K4组中的表达显著高于si-NC组（P < 0.05，见图6D）。最终，我们通过Western blot检测了不同组别小鼠皮肤组织中MAP2K4、COL1A1、α-SMA和TNF-α的蛋白表达水平。结果显示，Western blot检测到的蛋白表达趋势与RT-qPCR检测到的mRNA表达水平一致（见图6E）。这些结果表明，MAP2K4的敲低能够促进伤口愈合，提高miR-26a-5p的水平，并上调COL1A1和α-SMA的表达，同时下调TNF-α的表达。

### 讨论

我们的研究结果表明，miR-26a-5p/AMSC外泌体介导的伤口愈合机制在多个方面扩展了之前的研究。首先，我们通过生物信息学分析，鉴定了13个差异表达的miRNA和143个调控靶基因，这些基因富集于MAPK级联反应和多个与伤口愈合相关的信号通路，包括cAMP信号通路、relaxin信号通路、Hippo信号通路、Apelin信号通路、Wnt信号通路和cGMP-PKG信号通路。这些结果揭示了miRNA在伤口愈合中的广泛参与，同时也为miR-26a-5p在皮肤修复中的作用提供了新的视角。

其次，我们的动物实验表明，miR-26a-5p过表达的AMSCs来源的外泌体能够通过靶向MAP2K4，抑制炎症反应，并促进血管生成和细胞外基质的合成与沉积，从而加速伤口愈合。与之前的miR-26a-5p研究相比，我们的研究首次明确了miR-26a-5p在皮肤愈合中的具体作用，并验证了AMSCs来源的外泌体作为miR-26a-5p递送载体在皮肤修复中的优势。与hUCMSCs来源的外泌体相比，AMSCs来源的外泌体更容易从自体脂肪组织中分离，降低了临床应用中的免疫排斥风险，并且其外泌体本身含有促进皮肤修复的因子（如生长因子和脂质），这些因子能够与miR-26a-5p协同作用，提高伤口愈合效果。相比之下，直接使用miR-26a-5p agomir在体内稳定性较差，且缺乏这种协同效应。

此外，我们发现MAP2K4的敲低能够显著促进伤口愈合，提高miR-26a-5p的水平，并上调COL1A1和α-SMA的表达，同时下调TNF-α的表达。这些结果表明，MAP2K4在伤口愈合过程中起着关键的调控作用，而miR-26a-5p通过靶向MAP2K4，能够有效抑制其表达，从而促进伤口修复。这一发现为miR-26a-5p在皮肤修复中的应用提供了新的思路，并可能成为未来治疗策略的重要靶点。

尽管我们的研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。首先，我们应包括一个载有随机miRNA的外泌体对照组或未修饰的AMSCs来源的外泌体，以更全面和准确地验证miR-26a-5p在AMSCs来源的外泌体介导的伤口愈合中的特异性调控作用，并为miR-26a-5p在伤口治疗中的潜在应用提供更坚实的实验依据。其次，我们应进一步探讨MAPK级联反应和cAMP、relaxin、Hippo、Apelin、Wnt和cGMP-PKG信号通路在伤口愈合中的具体作用及其潜在机制。此外，其他miRNA在伤口愈合中的作用也值得在体外和体内进行深入研究。

综上所述，我们的研究通过生物信息学分析，鉴定了13个差异表达的miRNA和143个调控靶基因，这些基因富集于MAPK级联反应和多个与伤口愈合相关的信号通路，可能参与伤口修复过程。此外，动物实验结果表明，AMSCs来源的外泌体miR-26a-5p通过靶向MAP2K4，抑制炎症反应，并促进血管生成和细胞外基质的合成与沉积，从而加速伤口愈合。这些发现为使用AMSCs来源的外泌体作为载体，递送miR-26a-5p及其靶基因MAP2K4，以促进伤口愈合提供了理论基础。