直接RNA测序揭示了巨噬细胞在分枝杆菌（Mtb）感染过程中多层次的表转录组重塑

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Direct RNA sequencing reveals multilayered epitranscriptomic remodeling in macrophages upon Mtb infection

本研究利用Oxford Nanopore直接RNA测序技术，分析结核分枝杆菌感染THP-1巨噬细胞后的转录组及表转录组变化，揭示替代剪接、polyA尾缩短及多种RNA修饰（m6A、m5C、ψ、I）的动态变化，及其与炎症、代谢等通路的功能关联。

　　这项研究利用了第三代测序技术——牛津纳米孔技术（ONT）的直接RNA测序（DRS）方法，深入探讨了人类THP-1巨噬细胞在结核分枝杆菌（Mtb）感染后的转录组和表观转录组变化。研究结果揭示了感染过程中宿主细胞在多个层面的RNA加工调控机制，包括可变剪接、聚腺苷酸化（APA）以及RNA修饰的变化。这些发现不仅拓展了我们对宿主-病原体相互作用的理解，也为未来针对结核病的治疗策略提供了新的视角。

Mtb作为引起结核病的主要病原体，其感染具有高度的复杂性。它能够成功地在巨噬细胞内生存并复制，这一特性使其能够有效规避宿主的先天免疫防御机制。在感染过程中，Mtb不仅改变了宿主细胞的基因表达模式，还通过调控RNA的加工过程，进一步影响宿主的免疫应答。传统的二代RNA测序技术虽然在转录组研究中发挥了重要作用，但其局限性在于无法提供完整的转录本信息，也难以全面捕捉RNA修饰的动态变化。因此，第三代测序技术的引入，为研究RNA修饰和全转录本结构提供了前所未有的精确度。

DRS技术的核心优势在于其能够直接对未经过逆转录和扩增的RNA分子进行测序，从而避免了二代测序技术中常见的扩增偏差问题。这种技术不仅能够准确识别转录本异构体、融合转录本以及新的基因表达形式，还能够同时检测RNA上的修饰标记，如N6-甲基腺苷（m6A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）、假尿嘧啶（Ψ）和肌苷（I）等。通过分析这些修饰标记的分布和变化，研究团队发现Mtb感染显著影响了RNA的修饰模式，尤其是在不同基因区域中，如5′UTR、编码序列（CDS）和3′UTR。此外，修饰位点的偏好性也发生了变化，某些特定的碱基序列在感染后变得更加常见，而其他则减少。这种修饰的动态变化可能对RNA的稳定性、翻译效率以及免疫调控产生深远影响。

在研究过程中，科学家们通过分析转录本的分类代码（如gffcompare的分类体系），发现Mtb感染后，许多新的转录本被识别出来。这些新转录本可能代表了宿主在应对感染时的适应性反应，或者是由于病原体影响而产生的非典型表达形式。同时，通过Kegg通路分类，这些新转录本被归类到多个生物学功能中，包括代谢、宿主-病原体相互作用以及炎症反应等。这些结果表明，Mtb感染不仅改变了宿主的基因表达，还通过表观转录调控机制影响了多种细胞过程。

在可变剪接（Alternative Splicing, AS）方面，研究发现Mtb感染显著增加了某些剪接事件的频率，如外显子跳过（Exon Skipping, SE）和第一外显子替代（Alternative First Exon, AF），同时减少了内含子保留（Intron Retention, RI）事件的发生。这些变化可能反映了宿主细胞在感染后对基因表达的精细调控，以适应病原体的入侵。通过进一步的KEGG通路富集分析，科学家们发现这些剪接变化主要集中在与宿主免疫应答、炎症反应以及代谢相关的基因中。这表明，Mtb感染可能通过改变这些基因的剪接模式，影响宿主的免疫反应和代谢状态。

在聚腺苷酸化（Polyadenylation, APA）方面，研究团队发现Mtb感染导致了聚腺苷酸尾的全局缩短。这一现象与感染过程中细胞应激或免疫激活引起的翻译抑制密切相关。同时，研究还发现，在感染后，宿主细胞更倾向于使用远离转录起始位点的远端聚腺苷酸位点（Distal Poly(A) sites, DPS），而控制组则更依赖于靠近转录起始位点的近端聚腺苷酸位点（Proximal Poly(A) sites, PPS）。这种聚腺苷酸位点的选择变化可能影响mRNA的稳定性、翻译效率以及细胞内的调控网络。此外，研究还发现，感染后3′UTR的长度发生了显著变化，进一步支持了APA在调控宿主免疫反应中的作用。

在RNA修饰方面，研究团队检测了m6A、m5C、Ψ和I等多种修饰标记的变化。m6A修饰的减少主要发生在5′UTR和CDS区域，这可能影响了这些区域的翻译效率或mRNA的稳定性。而在3′UTR区域，m6A修饰则有所增加，这可能与mRNA的降解或微小RNA（miRNA）的调控有关。与此同时，Ψ修饰的富集区域从CDS转向了5′UTR，这种变化可能与翻译调控或免疫信号传导相关。而I修饰的变化则揭示了感染过程中RNA编辑的动态调整，这些编辑可能影响了宿主的免疫应答或代谢过程。

研究还发现，这些RNA修饰的变化与多个生物学通路密切相关，尤其是在宿主-病原体相互作用、炎症反应、细胞凋亡以及代谢调节方面。例如，m6A修饰的改变可能影响了宿主细胞对感染信号的响应，而Ψ和I修饰的变化可能与细胞内的信号传导机制有关。这些发现表明，RNA修饰不仅是基因表达调控的一部分，还可能在宿主防御机制中扮演关键角色。

尽管DRS技术为研究RNA修饰和转录组变化提供了强大的工具，但该研究也指出了其局限性。例如，DRS的测序误差率相对较高（5–12%），尤其是在同聚物插入或缺失的情况下。此外，该技术对高质量、全长RNA的需求可能限制了其在临床样本或低输入样本中的应用。为了克服这些挑战，科学家们建议进一步优化纳米孔化学技术、引入双链测序方法以及开发基于人工智能的碱基识别工具，以提高测序的准确性和通量。

综上所述，这项研究通过第三代测序技术，首次全面揭示了Mtb感染对宿主巨噬细胞的表观转录调控网络。研究结果不仅为理解Mtb如何影响宿主的免疫和代谢过程提供了新的线索，也为未来开发针对结核病的新型治疗策略奠定了基础。此外，研究团队还指出，未来的工作应结合单细胞测序、核糖体图谱分析以及功能实验，以进一步验证这些表观转录变化的具体作用机制，并探索其在病原体潜伏和免疫逃逸中的潜在意义。