综述：基于CRISPR的微流控生物传感平台正在将分子诊断技术从实验室研究推向临床应用（即“从实验台到患者身边”）

《Sensors & Diagnostics》：Microfluidic platforms for CRISPR-based biosensing advancing molecular diagnostics from benchtop to point-of-care

快速、精准且便携的生物标志物检测在临床诊断、食品安全和环境监测中至关重要。传统分子诊断技术因设备庞大、操作复杂而受限。本文综述了CRISPR-Cas系统与微流控技术的整合进展，涵盖离心微流控芯片、微滴、微流道阵列、μPAD和电化学芯片等平台，展示了其在病毒（如SARS-CoV-2）、细菌（如Salmonella）、真菌及毒素检测中的高灵敏度（LOD达fM级）和自动化优势。尽管已实现样本到答案（sample-to-answer）的一体化检测，但仍面临样本前处理繁琐、多路检测交叉干扰、规模化生产成本高等挑战。未来需结合人工智能优化信号分析，探索Cas14、Cas?等新蛋白，并推动标准化制造以实现临床应用。

　　在现代医学和生物技术领域，生物标志物的快速、准确和便携式检测技术正成为推动临床诊断、食品安全和环境监测的重要工具。传统的分子诊断方法，如聚合酶链式反应（PCR）和下一代测序（NGS），虽然具有极高的灵敏度，但往往受限于复杂的仪器设备、繁琐的实验步骤以及对专业操作人员的依赖，难以满足快速、便携和低成本的诊断需求。近年来，CRISPR–Cas技术与微流控技术的结合，为解决这些问题提供了一种全新的诊断思路。CRISPR–Cas系统以其极高的特异性和灵敏度而闻名，而微流控技术则具备微型化、集成化、高通量和自动化等优势。这种融合不仅提升了检测效率，还显著降低了资源消耗，为实现真正的“从样本到答案”（sample-to-answer）的即时诊断提供了可能。

CRISPR–Cas系统最初被发现是细菌和古菌的适应性免疫机制，用于识别并清除入侵的病毒（噬菌体）和外源遗传物质。在这一系统中，CRISPR序列作为细菌的“记忆库”，记录了曾经感染过的病毒基因片段。Cas蛋白则是执行系统功能的关键，能够与CRISPR序列结合，精准识别目标核酸并进行切割。通过人工设计，CRISPR–Cas系统可以被用于检测特定的DNA或RNA序列，其中某些Cas蛋白（如Cas12、Cas13和Cas14）具有“旁观切割”（collateral cleavage）特性，即在识别目标核酸的同时，还能对周围的核酸进行非特异性切割，从而产生可检测的信号，例如荧光或颜色变化。这一特性使得CRISPR–Cas系统在生物标志物检测中具有极高的灵敏度，同时避免了传统方法中需要预扩增步骤的局限。

为了进一步提升CRISPR–Cas系统的实用性，微流控技术的引入成为关键。微流控技术能够通过精确控制微尺度下的流体运动，实现样本处理、扩增和检测过程的集成化。这种技术不仅减少了样本和试剂的使用量，还有效降低了操作复杂性，同时减少了人为操作带来的污染风险。此外，微流控芯片还可以通过集成多种功能模块，如样品纯化、混合、扩增和检测，将整个实验流程浓缩到一个小型化设备中，从而实现自动化和高通量检测。通过结合纳米材料和微流控技术，还可以进一步优化信号放大和检测效率，例如利用纳米颗粒作为信号传递的媒介，提高检测的可视化和灵敏度。

微流控技术在CRISPR–Cas系统中的应用主要体现在多个方面。例如，离心式微流控芯片通过旋转实现流体的流动，适用于多步骤的自动化操作，如样本加载、目标捕获、清洗、核酸提取和检测。这种芯片不仅操作简便，还能实现快速检测，适用于多种生物标志物的检测，如细菌、病毒、真菌、毒素等。同时，微滴微流控技术利用油水不相溶的特性，将反应封装在微小的水滴中，从而实现高通量、并行的检测，避免了交叉污染。微流控阵列芯片则通过预设的反应结构，实现了多目标的同时检测，特别适用于需要高灵敏度和高特异性的场景。纸基微流控芯片（μPAD）则因其低成本、易于使用和无需外部电源的特性，成为资源匮乏地区或家庭使用的理想工具。电化学微流控芯片通过将生物分子识别转化为可测量的电信号，使得检测过程更加简便，且无需依赖复杂的光学设备。

CRISPR–Cas与微流控技术的结合在多个生物标志物检测领域取得了显著进展。例如，在核酸检测方面，通过整合CRISPR–Cas12a和微滴技术，可以实现对多种病毒（如SARS-CoV-2）的高灵敏度检测，其检测限（LOD）可以达到单个拷贝级别。在细菌检测中，微流控平台能够通过自动化流程快速识别多种病原体，同时利用“活细胞识别”技术，区分存活与死亡的细菌，避免假阳性结果。对于真菌和毒素的检测，微流控技术与CRISPR–Cas的结合也展示了其独特的优势，例如通过检测真菌的18S rRNA或毒素浓度，实现了高精度的识别。此外，该技术还可以用于检测蛋白质类生物标志物，如通过CRISPR–Cas12a与纳米材料的结合，实现了对单细胞内ATP的检测，从而为细胞活性分析提供了新的思路。

尽管CRISPR–Cas与微流控技术的结合带来了诸多优势，但其在实际应用中仍面临一些挑战。例如，样本制备过程的自动化仍然存在困难，特别是在处理复杂的生物样本（如血液、唾液和拭子）时，如何高效提取核酸和去除杂质仍是技术瓶颈。此外，多通道检测需要精确的芯片设计和多组guide RNA的协同工作，这可能导致信号干扰或解释复杂性。因此，未来的研发方向应集中在如何进一步简化芯片设计、优化检测流程，并提升检测系统的稳定性和可重复性。同时，标准化的检测协议和平台间的互操作性也是实现该技术大规模应用的重要前提。

随着人工智能（AI）和数字技术的发展，CRISPR–Cas与微流控系统的结合也在向智能化方向迈进。例如，通过集成智能手机或其他便携式设备，检测信号可以被实时采集和分析，进一步提高检测的自动化水平和准确性。此外，AI算法还可以用于优化检测流程，提高数据处理效率，并减少误判。这种技术的融合使得“从样本到答案”的诊断流程更加高效和可靠，同时也为大规模疾病监测和个性化医疗提供了新的可能。

在实际应用中，CRISPR–Cas与微流控技术的结合已经展现出巨大的潜力。例如，在疫情爆发期间，该技术被用于快速检测新冠病毒（SARS-CoV-2），在短时间内实现了高灵敏度和高特异性的诊断。同时，该技术也拓展到食品安全和农业病害检测领域，为多种病原体和毒素的检测提供了新的手段。在临床环境中，该技术还能够用于精准医疗和疾病监测，特别是在资源匮乏地区，通过简化操作流程和降低设备成本，使分子诊断技术更易于普及和使用。

总体而言，CRISPR–Cas与微流控技术的结合正在推动分子诊断技术向更加便捷、高效和普及的方向发展。通过不断优化芯片设计、信号转换机制和检测流程，这一技术有望成为未来全球疾病监测和精准医疗的重要工具。随着技术的成熟和标准化的推进，这种“从样本到答案”的诊断方式将在临床、食品安全和环境监测等多个领域发挥关键作用，为实现真正意义上的即时诊断（point-of-care testing, POCT）提供坚实的技术基础。