自反馈DNA酶电路驱动的无标记、信号激活型CRISPR/Cas12a电化学生物传感器，用于超灵敏检测肝癌生物标志物

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Self-feedback DNAzyme circuit-powered label-free and signal-on CRISPR/Cas12a electrochemical biosensor for ultrasensitive detection of liver cancer biomarkers

基于DNA四面体纳米结构和CRISPR/Cas12a的电化学生物传感平台，实现了AFP和miRNA-122的高灵敏度检测。通过DNAzyme自反馈放大系统，在无靶标时为"信号-off"模式，检测限达5.36 fg·mL?1和7.58 aM，成功区分肝癌患者与健康人群。

　　本研究提出了一种新型的“信号开启”型电化学生物传感平台，用于高灵敏度地检测肝癌生物标志物α-胎蛋白（AFP）和miRNA-122。该平台通过将DNA四面体纳米结构（DTN）与CRISPR/Cas12a系统以及DNA酶自反馈放大系统相结合，实现了对这两种生物标志物的精准识别。这一设计不仅提高了检测的特异性与灵敏度，还降低了背景噪声，使得该平台在临床诊断中具有广泛的应用前景。

肝癌是一种在全球范围内高发的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居于前列。据相关数据统计，肝癌是第五大常见的癌症类型，同时也是癌症相关死亡的第二大原因。因此，提高肝癌的早期诊断能力显得尤为重要。肿瘤标志物的检测在癌症筛查、疾病评估以及良恶性疾病的鉴别中起着关键作用。然而，单一标志物的检测往往存在局限性，因为其特异性不足，难以提供可靠的诊断依据。因此，结合多种肿瘤标志物进行综合分析，有助于提高诊断的准确性。

在众多肿瘤标志物中，α-胎蛋白（AFP）是应用最为广泛的血清标志物之一。它主要在胎儿肝脏和卵黄囊中表达，出生后逐渐减少。AFP在肝癌的早期诊断中具有重要价值，是临床上常用的检测指标。此外，miRNA作为一种非编码的小分子RNA，近年来也引起了广泛关注。miRNA-122是肝脏特异性miRNA中的一种，其在健康个体的肝脏miRNA库中占比高达70%。然而，在肝癌患者中，miRNA-122的表达水平显著下降，这使得其成为肝癌检测的潜在标志物。因此，实现对AFP和miRNA-122的高灵敏度检测，对于肝癌的早期诊断和治疗具有重要意义。

CRISPR/Cas系统因其严格的碱基互补依赖性切割机制、高度的可编程性以及操作简便性，已被广泛应用于生物传感领域。特别是Cas12a和Cas13a这两种变体，已被成功用于多种目标的检测，包括膜蛋白、miRNA以及病毒DNA等。这些系统的引入为生物传感技术提供了更高的特异性和灵敏度，尤其是在复杂的血清环境中。然而，当前基于CRISPR/Cas12a的检测方法仍面临一定的挑战，尤其是对大多数生物靶标的检测灵敏度不足。这是因为生物样本中这些靶标的浓度通常较低，导致信号输出微弱，难以满足临床检测的需求。

为了克服这一问题，研究人员尝试将CRISPR/Cas12a系统与等温扩增技术相结合，以显著提升检测灵敏度。尽管这一方法在提高灵敏度和特异性方面取得了显著成效，但其在临床应用中仍受到限制，主要原因是其依赖复杂的核酸修饰和标记过程，这不仅增加了实验成本，也降低了检测的便捷性。因此，开发一种操作简便、成本低廉且具有高灵敏度的检测平台，成为当前研究的重点。

G-四链体（G4）是一种由富含鸟嘌呤的序列通过Hoogsteen氢键形成的四链核酸结构。G4结构能够特异性地结合血红素（hemin），从而形成具有类过氧化物酶活性的G4/hemin DNA酶复合物。这一复合物不仅具有独特的催化性能，还具备简便的合成方法、低成本以及无需标记的信号输出优势。因此，将G4/hemin系统与基于CRISPR/Cas12a的等温扩增传感平台相结合，有望在提升检测灵敏度的同时，显著降低检测成本并简化实验流程。

在本研究中，研究人员设计了一种基于DTN的“信号开启”型电化学生物传感器，用于AFP和miRNA-122的无标记检测。该传感器利用DTN作为支撑平台，其结构稳定、生物相容性良好，并且具有高度的可编程性。DTN的三个顶点通过硫醇基团锚定在金电极表面，而第四个顶点则连接了一段单链DNA（C1）。在没有目标分子的情况下，CRISPR/Cas12a系统被激活，导致C1在DTN的顶点处被切割，使得血红素分子从电极表面脱离，从而产生较弱的电化学信号。此时，传感器处于“信号关闭”状态。

当目标分子存在时，miRNA-122或AFP会与相应的互补序列或适配子序列特异性结合，释放出S1分子。S1随后触发DNA酶自反馈放大级联反应，生成大量H2-1分子。H2-1能够与S3竞争结合，从而阻止CRISPR/Cas12a系统的激活。此时，C1能够自我折叠形成G4结构，并与血红素结合，最终形成稳定的G4/hemin复合物。这一过程显著增强了电化学信号的输出，使得传感器进入“信号开启”状态。通过监测电化学信号的变化，研究人员能够实现对AFP和miRNA-122的高灵敏度、无标记检测。

这一传感平台的设计充分利用了DTN的结构优势，确保了信号探针的有序分布，同时减少了非特异性吸附的可能性。此外，该平台还具备并行检测两种生物标志物的能力，为肝癌的早期诊断提供了新的思路。实验结果显示，该平台对miRNA-122的检测限低至7.58 aM，对AFP的检测限则为5.36 fg·mL?1（信噪比S/N = 3），这表明其在灵敏度方面具有显著优势。更重要的是，该平台已被成功应用于临床血清样本的检测，能够有效区分健康个体和肝癌患者的样本，展现出广阔的应用前景。

在实验方法方面，研究人员详细描述了所使用的试剂和材料。其中，AFP的适配子序列由Dong等人筛选得出，具有高特异性和强结合亲和力（Kd = 0.5 μM）。该适配子序列已被广泛应用于AFP的生物传感检测。此外，还使用了Mg2?依赖的DNA酶，其序列包含两个严格保守的区域，能够高效催化特定反应。这些试剂和材料的选择为实验的顺利进行提供了保障。

该生物传感器的工作原理基于CRISPR/Cas12a系统与DNA酶自反馈放大系统的协同作用。在传感器的构建过程中，首先将单链T1、T2、T3和T4混合，并通过热退火程序驱动它们的自组装，形成DTN结构。DTN的结构不仅为信号分子的固定提供了支撑，还确保了探针在电极表面的有序分布。同时，由于DTN的刚性结构，能够有效减少非特异性吸附，从而提高检测的准确性。

在信号输出方面，该传感器利用了G4/hemin复合物的电化学特性。当目标分子存在时，DNA酶自反馈放大系统被激活，生成大量H2-1分子，这些分子能够竞争性地结合S3，从而阻止CRISPR/Cas12a系统的激活。此时，C1能够自我折叠形成G4结构，并与血红素结合，形成稳定的G4/hemin复合物。这一复合物在电化学检测中表现出优异的信号响应能力，使得检测结果更加显著。

此外，该平台的设计还考虑到了实验的可操作性和成本效益。通过将DTN与CRISPR/Cas12a系统以及DNA酶自反馈放大系统相结合，研究人员不仅实现了高灵敏度的检测，还简化了实验流程，降低了试剂和设备的成本。这种设计使得该平台在实际应用中更具可行性，尤其是在资源有限的临床环境中。

该研究的结论表明，基于DTN的“信号开启”型电化学生物传感器在检测AFP和miRNA-122方面具有显著优势。该平台通过有序的探针分布和有效的信号增强机制，实现了低背景噪声和高灵敏度的检测。同时，其并行检测能力为多标志物联合分析提供了可能，有助于提高肝癌早期诊断的准确性。实验结果表明，该传感器在临床血清样本中表现出良好的检测性能，能够有效区分健康个体和肝癌患者的样本。

在作者贡献方面，Qianling Xiong作为本科生，主要负责研究的实施与数据的收集。Li Zhu则负责原始论文的撰写。Yongjiao Song、Tao Zhang、Ya Zhou、Li Yang和Liping Zhu均参与了论文的撰写、审阅和修改，并在实验设计、数据分析和项目管理等方面提供了重要支持。Liping Zhu还负责项目的资金申请和管理，确保研究工作的顺利进行。

在利益冲突声明中，作者表示他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本研究的成果。这一声明表明研究结果的客观性和可靠性，为该平台的进一步推广和应用奠定了基础。

总之，本研究提出了一种创新的“信号开启”型电化学生物传感器，用于AFP和miRNA-122的高灵敏度检测。该平台结合了DTN的结构优势、CRISPR/Cas12a系统的高特异性以及DNA酶自反馈放大系统的高效信号增强机制，实现了低背景噪声、高灵敏度和操作简便的检测方法。该传感器在临床血清样本中的应用验证了其在肝癌早期诊断中的潜力，为未来的癌症检测技术提供了新的思路和方法。