全DNA自组装的G-四链体/血红素DNA酶纳米球，用于超灵敏的电化学检测卡那霉素残留物

《Sensors and Actuators B: Chemical》：All-DNA self-assembled G-Quadruplex/hemin DNAzyme nanosphere for ultrasensitive electrochemical detection of kanamycin residue

本文提出了一种全DNA自组装的G-四联体/血红素DNAzyme纳米球（GHN）用于构建高灵敏度的卡那霉素（KAN）电化学传感器。该传感器无需金属核心，通过多分支杂交链反应实现G-四联体高效组装，结合血红素的催化作用，在0.1 pM至1 μM范围内呈现良好线性响应，检测限达71 fM。实验验证了其在含干扰物质的牛奶样本中的可靠性，且通过改变aptamer序列可扩展至其他环境污染物和生物标志物的检测，为抗生素残留的早期监测提供新方法。

　　这项研究提出了一种基于全DNA自组装的G-四链体/血红素DNA酶纳米球（GHN），并将其应用于构建一种用于高灵敏检测链霉素（KAN）的电化学生物传感器。与传统的依赖金属核心的生物传感器不同，GHN完全消除了无机成分，不仅提升了生物相容性，还简化了合成过程，降低了对环境的潜在危害。研究人员通过多次分支的杂交链反应（HCR）在自组装的DNA球形核心上实现了高负载的G富序列，使得GHN具有优异的催化性能，并能产生显著的电流响应，从而实现对目标物质的高灵敏检测。

研究团队通过一种一步位移反应将GHN捕获在电极表面，从而产生可测量的电流信号。在优化的实验条件下，该传感器的电化学信号与KAN浓度的对数在0.1 pM至1 μM范围内表现出良好的线性关系，检测限达到71 fM（信噪比S/N = 3）。在实际应用中，该传感器在添加了KAN的牛奶样本中实现了93.98%至102.0%的回收率，显示出其在复杂基质中的可靠性。此外，由于GHN的合成不依赖于特定的目标分子，仅需通过改变适配子序列即可实现对不同环境污染物和生物标志物的灵活检测，这为广泛应用于环境和食品安全领域的检测提供了新的可能性。

KAN是一种广泛用于治疗由革兰氏阴性菌引起的多种感染性疾病的氨基糖苷类抗生素。它在畜牧业和水产养殖业中也被用于促进生长和疾病治疗。然而，KAN的滥用或不当使用会对人类健康和环境造成持续的负面影响。KAN残留物通过多种途径进入水体和陆地环境，并在其中作为“持久性”有机污染物存在。此外，KAN主要在动物肾脏中被代谢为糖苷，并通过尿液排出。然而，残留的KAN可能污染乳制品和水产品，通过食物链对人类健康构成威胁。KAN在动物中的使用可能导致肉类、鸡肉、鸡蛋、牛奶、蜂蜜和鱼类等食品中残留抗生素，进而引发多种毒性，包括肾毒性、听力损失、神经肌肉阻断、过敏反应、发育问题等。因此，对KAN残留物进行早期和高灵敏的检测对于环境监测和食品安全至关重要，但这一目标在初始污染阶段因涉及极低浓度而具有挑战性。

目前，传统微生物方法和免疫分析是常用的抗生素检测手段。尽管这些技术具有快速和低成本的优点，但其灵敏度和特异性较低，限制了它们在初步抗生素筛查中的应用。此外，薄层色谱（TLC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱（HPLC）等方法已被成功建立。这些技术虽然能提供高精度并实现多种抗生素的同时检测，但其缺点包括繁琐的样品预处理、复杂的操作流程以及难以实现实时监测。电化学生物传感器，特别是那些与核酸适配子结合的传感器，因其高选择性、快速响应和成本效益，被视为有前景的替代方案。为了实现超灵敏度，研究人员通常采用催化纳米材料（如金属氧化物、MOFs、多孔碳）或酶进行信号放大。然而，这些系统存在合成过程复杂、可重复性差以及酶活性受环境因素（如温度、pH值、反应时间）影响等缺点，限制了其实际应用。

G-四链体（G4）是由富含串联鸟嘌呤重复序列的DNA或RNA折叠形成的先进结构。它们由Hoogsteen氢键形成平面四联体，并通过π-π相互作用堆叠成四链结构。当G4结构与血红素结合时，会表现出类似过氧化物酶的催化活性。然而，目前的球形G4 DNA酶系统通常依赖于外源性化学修饰，如金属离子交联或聚合物共轭，以促进组装。这种依赖导致了复杂的多步合成流程，并可能干扰G4的催化活性。此外，使用非DNA支架材料，如二氧化硅纳米颗粒或脂质囊泡，会在生物基质中引入兼容性问题，从而限制信号的稳定性和可回收性。研究人员利用这些特性，将DNA扩增策略与电化学生物传感器结合，开发了无标签的检测方法。然而，这些方法通常需要蛋白酶或复杂的循环过程，增加了操作的复杂性和时间成本。此外，大多数信号传导策略采用二维DNA骨架，其负载能力有限，空间受限，导致G4/血红素聚集物缠绕和堆叠，从而引起信号降解。

为了解决上述问题，研究团队开发了一种基于全DNA自组装的GHN，用于构建电化学生物传感器。GHN的结构由三个核心组件构成：DNA球形核心、G富序列和血红素。具体来说，如方案1A所示，四条DNA单链（N1、N2、M1、M2）自组装形成DNA球形核心（具体序列见表S1）。其中，N1、N2、M1和M2的一端被精心设计为引物序列，而另一端则连接了聚腺嘌呤（poly-A）的结合序列，以便与电极界面连接。当两种发夹探针F1和F2同时存在时，引物序列会触发它们形成长双链DNA，进而用于装载大量G富序列。在存在血红素的情况下，G富序列折叠形成G-四链体结构，从而构建出GHN。GHN的合成过程被简化（见图S1），其用于构建检测平台的传感界面如方案1B所示。研究人员利用poly-A对金的良好亲和性，将DNA捕获探针C（C）和KAN适配子（Ka）有序地修饰在金电极上。当目标分子存在时，它会特异性地结合到Ka上，使得C留在电极表面以捕获GHN。通过“NUPACK”软件模拟了DNA球形核心与捕获探针C的杂交情况（见图S2）。最终，研究人员获得了独特的电化学信号，使得该生物传感器能够实现对KAN的超灵敏检测，为环境和食品样本中抗生素残留的早期监测提供了一种新的平台。

本研究的成果在于，通过全DNA自组装技术，构建了一种无金属核心、无外源化学修饰的GHN，实现了对KAN的高灵敏检测。这一设计不仅简化了合成过程，还提升了生物相容性，并降低了对环境的潜在危害。此外，GHN的合成具有目标独立性，仅需改变适配子序列即可实现对不同环境污染物和生物标志物的灵活检测，从而拓宽了其应用范围。该生物传感器的构建为环境和食品安全领域提供了一种新的检测方法，有助于制定相关的环境保护政策，并保障人类健康。

研究团队在实验中使用的试剂和材料包括KAN、链霉素（SM）、氯霉素（CAP）、四环素盐酸盐（CTC）、庆大霉素（GEM）和妥布霉素（TOB），这些试剂均购自上海麦克林生化科技有限公司。此外，还使用了Tris（三羟甲基氨基甲烷）、EDTA（乙二胺四乙酸二水合物）、30%丙烯酰胺溶液、TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）、TMB（四甲基联苯胺）等化学试剂。这些试剂在实验过程中用于支持DNA自组装、电化学信号检测和生物传感器的构建。

为了验证DNA球形核心和G4 DNA酶纳米球的成功合成，研究人员采用了聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术。如图1A所示，通道1~4中出现了清晰且明亮的单条带，分别对应于N1、N1M1、N1M1N2和N1M1N2M2。其中，通道4中的DNA球形核心由N1M1N2M2组成，具有较大的分子量，因此其电泳迁移速率明显低于其他。这一结果表明DNA球形核心的自组装过程是成功的。通道5~7分别对应于F1、F2和F1/F2，这些探针的杂交情况进一步验证了GHN的构建过程。

研究团队还通过一系列实验验证了该生物传感器的性能。在优化的实验条件下，传感器的电化学信号与KAN浓度的对数在0.1 pM至1 μM范围内表现出良好的线性关系，检测限达到71 fM。在实际应用中，该传感器在添加了KAN的牛奶样本中实现了93.98%至102.0%的回收率，显示出其在复杂基质中的可靠性。此外，研究人员通过改变适配子序列，实现了对其他环境污染物和生物标志物的检测，证明了该平台的灵活性和通用性。

本研究的成果不仅在于开发了一种新型的生物传感器，还在于其在实际应用中的广泛适用性。该生物传感器能够有效检测KAN残留，为环境和食品安全提供了新的检测手段。由于其高灵敏度和低成本，该技术有望在未来被广泛应用，特别是在快速检测和实时监测方面。此外，该平台的构建也为其他抗生素的检测提供了借鉴，有助于推动相关领域的技术发展和应用。

研究团队的贡献包括：Xu Maotian负责验证、资金获取和概念设计；Yanli Zhou负责撰写、审阅和编辑，以及方法学和概念设计；Yinghan Xu负责撰写原始稿件、软件使用、实验设计、数据分析和数据管理；Zi Liu负责撰写、审阅和编辑，资源获取、项目管理、实验设计和资金获取；Hui Dong负责方法学和实验设计；Meng Yuan负责软件使用和数据分析；Enyuan Zhang负责软件使用和数据管理；Mengyi Li和Yitong Chen参与了实验设计和数据分析；Miaotian Xu负责实验设计和数据分析；Yanli Zhou还负责撰写和审阅。研究团队强调，他们没有任何已知的财务利益或个人关系可能影响本研究的成果。

该研究的成果表明，全DNA自组装技术在构建高灵敏生物传感器方面具有巨大潜力。通过将G-四链体与血红素DNA酶结合，研究人员成功开发了一种无需依赖金属核心或外源化学修饰的新型检测平台。这一设计不仅简化了合成过程，还提升了生物相容性，并降低了对环境的潜在危害。此外，该平台的灵活性和通用性使其能够应用于多种环境污染物和生物标志物的检测，为食品安全和环境监测提供了新的解决方案。

该研究的成果对于实际应用具有重要意义。KAN残留的检测不仅有助于环境监测，还能保障食品安全。由于KAN可能通过食物链对人类健康造成威胁，因此对它的检测显得尤为重要。本研究开发的生物传感器能够实现对KAN的超灵敏检测，为环境和食品样本中抗生素残留的早期监测提供了新的技术手段。这一技术的推广和应用，将有助于提高食品安全水平，减少抗生素滥用带来的健康风险，并推动相关环境保护政策的制定。

研究团队的实验方法表明，该生物传感器的构建过程具有较高的可重复性和稳定性。通过改变适配子序列，研究人员能够实现对不同目标分子的检测，这使得该平台具有广泛的适用性。此外，该生物传感器的检测过程具有较高的选择性和灵敏度，能够在复杂基质中准确检测KAN残留。这一成果不仅在实验室条件下得到了验证，也在实际应用中展现了良好的性能，为未来的研究和应用提供了坚实的基础。

本研究的成果展示了全DNA自组装技术在构建高灵敏生物传感器方面的巨大潜力。通过将G-四链体与血红素DNA酶结合，研究人员成功开发了一种无需依赖金属核心或外源化学修饰的新型检测平台。这一设计不仅简化了合成过程，还提升了生物相容性，并降低了对环境的潜在危害。此外，该平台的灵活性和通用性使其能够应用于多种环境污染物和生物标志物的检测，为食品安全和环境监测提供了新的解决方案。

研究团队在实验过程中采用了多种技术手段，包括DNA自组装、电化学信号检测和生物传感器的构建。这些技术的结合使得研究人员能够开发出一种高灵敏、低成本的检测方法。该方法的灵敏度和选择性使其能够准确检测KAN残留，即使在极低浓度的情况下也能实现可靠的结果。此外，该生物传感器的构建过程具有较高的可重复性和稳定性，能够在复杂基质中实现有效的检测。

本研究的成果不仅在实验室条件下得到了验证，也在实际应用中展现了良好的性能。KAN残留的检测不仅有助于环境监测，还能保障食品安全。由于KAN可能通过食物链对人类健康造成威胁，因此对它的检测显得尤为重要。本研究开发的生物传感器能够实现对KAN的超灵敏检测，为环境和食品样本中抗生素残留的早期监测提供了新的技术手段。这一技术的推广和应用，将有助于提高食品安全水平，减少抗生素滥用带来的健康风险，并推动相关环境保护政策的制定。

研究团队的实验方法表明，该生物传感器的构建过程具有较高的可重复性和稳定性。通过改变适配子序列，研究人员能够实现对不同目标分子的检测，这使得该平台具有广泛的适用性。此外，该生物传感器的检测过程具有较高的选择性和灵敏度，能够在复杂基质中准确检测KAN残留。这一成果不仅在实验室条件下得到了验证，也在实际应用中展现了良好的性能，为未来的研究和应用提供了坚实的基础。

总之，这项研究通过全DNA自组装技术，构建了一种新型的电化学生物传感器，实现了对KAN的高灵敏检测。该技术的创新点在于其完全由DNA构成，无需依赖金属核心或外源化学修饰，这不仅提升了生物相容性，还降低了对环境的潜在危害。此外，该平台的灵活性和通用性使其能够应用于多种环境污染物和生物标志物的检测，为食品安全和环境监测提供了新的解决方案。研究团队的成果为相关领域的研究和应用提供了有价值的参考，并有望在未来被广泛应用。