靶向多药耐药霍乱弧菌DGCs的黄酮类化合物抗生物膜机制研究：白杨素与菲瑟酮的干预效应

《Scientific Reports》：Flavonoids interfere with biofilm formation by targeting diguanylate cyclases in multidrug resistant Vibrio cholerae

本研究针对全球范围内日益严重的抗生素耐药性问题，以霍乱弧菌（Vibrio cholerae）生物膜为靶点，探索天然黄酮类化合物白杨素（baicalein）与菲瑟酮（fisetin）的抗生物膜潜力。研究人员通过体外实验、基因表达分析及分子模拟技术，首次揭示两种黄酮可通过抑制双鸟苷酸环化酶（DGCs）活性，干扰第二信使c-di-GMP信号通路，显著破坏霍乱弧菌生物膜形成及其耐药性。该研究为开发新型抗霍乱策略提供了理论依据，对应对多重耐药菌感染具有重要意义。

　　

霍乱，这一曾被视作“被遗忘的瘟疫”，至今仍在全球南部地区（如南亚、东南亚、非洲及拉丁美洲）持续肆虐。世界卫生组织数据显示，2023年全球霍乱病例数较2022年增长13%，死亡率飙升126%，凸显其严峻的公共卫生威胁。霍乱弧菌作为病原体，不仅能在水生环境中长期存活，更擅长通过形成生物膜（biofilm）在人体肠道中顽固定植。这种“微生物堡垒”使细菌对抗生素的耐受性提升数十倍，导致传统疗法频频失效。尤其令人担忧的是，多重耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）霍乱弧菌株的涌现，使得本已有限的治疗选择雪上加霜。在疫苗保护期有限、抗生素疗效下降的背景下，靶向生物膜已成为对抗霍乱的新希望。

近日，发表于《Scientific Reports》的一项研究首次揭示：两种天然黄酮类化合物——白杨素（baicalein）与菲瑟酮（fisetin），可通过精准抑制霍乱弧菌的双鸟苷酸环化酶（DGCs），阻断其环二鸟苷酸（c-di-GMP）信号通路，从而高效瓦解生物膜。该研究不仅明确了化合物的活性浓度，还通过分子模拟阐明了菲瑟酮更具优势的结构机制，为抗霍乱药物研发提供了新靶点与先导化合物。

为系统评估黄酮类化合物的抗生物膜效能，研究团队选取两株高生物膜形成能力的MDR霍乱弧菌临床分离株（TM14与TM36），通过微量稀释法测定最小生物膜抑制浓度（MBIC）与最小生物膜清除浓度（MBEC）；借助扫描电镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）直观观察生物膜结构变化；采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析生物膜相关基因表达；并利用分子对接与分子动力学（MD）模拟预测化合物与DGC活性中心的结合模式。此外，通过细胞毒性实验与溶血活性检测验证化合物生物相容性，依托SwissADME和ProTox-3平台进行ADMET（吸收、分布、代谢、排泄、毒性）特性预测。

黄酮类化合物展现低毒性且高效抗生物膜活性

研究发现，白杨素与菲瑟酮在50–100 μg/mL浓度范围内对人淋巴细胞存活率均高于75%，溶血活性低于20%，表明其具有良好生物安全性。菲瑟酮的抗生物膜效能显著优于白杨素：其对霍乱弧菌的MBIC为30 μg/mL，MBEC为50 μg/mL，而白杨素分别为40 μg/mL和70 μg/mL。扫描电镜图像清晰显示，经黄酮处理后，细菌生物膜结构由致密网状退化为稀疏碎片，且菲瑟酮处理组中几乎无完整菌体聚集。

黄酮破坏生物膜基质结构与代谢功能

通过酚硫酸法与Lowry法测定，菲瑟酮使胞外聚合物（EPS）中多糖含量降低53.5%，蛋白质含量降低46.6%。原子力显微镜进一步显示，菲瑟酮将生物膜厚度从1.31 μm削减至0.52 μm，表明白黄酮能有效瓦解生物膜物理屏障。MTT实验表明，黄酮处理后的生物膜代谢活性下降约50%，提示其可能通过抑制能量代谢关键酶（如磷酸果糖激酶）削弱细菌生存能力。

黄酮削弱细菌黏附与信号分子合成

菲瑟酮使霍乱弧菌菌体自聚能力降低37.9%，表面疏水性下降43.3%，显著抑制其附着于生物或非生物表面。此外，黄酮处理导致细菌吲哚产量下降51.9%，该分子作为群体感应信号分子，原本可激活生物膜调控蛋白VpsR与VpsT，其减少进一步佐证黄酮对群体感应系统的干扰。

靶向DGC-c-di-GMP通路是抗生物膜核心机制

基因表达分析发现，菲瑟酮使6种关键DGCs（cdgA、cdgH、cdgK、cdgL、cdgM、vpvC）的表达量下调42.7%–75.8%，其中对cdgH与cdgM的抑制最为显著。下游调控因子aphA（c-di-GMP活性标志物）表达量降低63.8%，vpsT（依赖c-di-GMP激活）表达量下降66.3%，证实黄酮通过降低细胞内c-di-GMP水平，阻断生物膜形成信号通路。

分子模拟揭示菲瑟酮优势结合模式

分子对接显示，菲瑟酮与DGC活性中心（GGDEF结构域）结合能为-6.9 kcal/mol，优于白杨素（-6.3 kcal/mol）。菲瑟酮的C3、C4、C7、C3′位羟基与Glu238形成三重氢键，该残基是GTP底物催化关键位点，其结合可直接阻断c-di-GMP合成。分子动力学模拟中，菲瑟酮-蛋白复合物的RMSD（均方根偏差）始终低于0.3 nm，RMSF（均方根涨落）与R_g（回转半径）值均表明显著结构稳定性，从理论上解释了菲瑟酮的高效性。

本研究首次系统证实黄酮类化合物可通过靶向DGCs调控c-di-GMP通路，瓦解霍乱弧菌生物膜。菲瑟酮因其羟基位置优化（C3、C4、C7、C3′），展现更强抑制效能，且具备低毒性、高胃肠吸收度与无神经毒性等优势。该发现不仅为抗霍乱药物设计提供了新靶点（DGCs），还提示天然黄酮可作为“抗生物膜-表面消毒”双功能制剂，用于水源、食品容器等生物膜清除。未来研究需进一步开展动物模型验证，推动该类化合物向临床转化，助力WHO“2030年将霍乱死亡率降低90%”的防控目标。