塞尔维亚蓝莓冠瘿病新病原——疫苗类伞形农杆菌（Agrobacterium vacciniicorymbosi sp. nov.）的发现与多相分类鉴定

《Scientific Reports》：Isolation and characterization of Agrobacterium vacciniicorymbosi sp. nov. originating from crown galls in blueberry (Vaccinium corymbosum) in Serbia

本研究针对塞尔维亚蓝莓种植区新发现的冠瘿病问题，通过多相分类学方法鉴定出一种新的伞形农杆菌物种。研究人员通过多位点序列分析(MLSA)、全基因组测序和平均核苷酸一致性(ANI)分析，证实该菌株与已知伞形农杆菌物种的ANI值低于86%，且具有独特的表型特征。尽管缺乏肿瘤诱导(Ti)质粒，该菌仍能在蓝莓上诱导瘿瘤形成，这对理解农杆菌致病机制具有重要意义。研究成果发表于《Scientific Reports》，为蓝莓病害防控提供了新依据。

　　

随着全球对蓝莓（Vaccinium corymbosum L.）需求的持续增长，这种作物已成为现代水果生产的重要角色，特别是在高度发达国家。在塞尔维亚，高丛蓝莓是非常受欢迎的经济作物，目前种植面积约2500公顷，且产量呈增长趋势。然而，集约化生产与植物材料的贸易和进口导致了新植物病原体的不断出现。此前，塞尔维亚蓝莓上唯一已知的细菌性病原是丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. syringae）。

伞形农杆菌（Agrobacterium）、异根瘤菌属（Allorhizobium）和根瘤菌属（Rhizobium）的细菌是引起经济重要作物冠瘿病、肿瘤和毛根病的病原体。这些病原体分布广泛，造成严重的产量损失，降低了作物生产的经济效益。伞形农杆菌通过其Ti质粒（肿瘤诱导质粒）将T-DNA转移到植物细胞中，整合到植物染色体上，编码合成生长素、细胞分裂素和冠瘿碱的酶，这一特性也被广泛应用于植物基因工程。携带Ti质粒的菌株会引起冠瘿病，其特征是在根和茎上形成大的肿瘤状瘿瘤。而携带Ri（根诱导）质粒的菌株则诱导毛根病。Ti质粒携带的vir基因编码IV型分泌系统（T4SS）和其他处理并将T-DNA转运到植物细胞中进行转化所必需的元件。

在蓝莓上，已有报道称伞形农杆菌生物变种1（A. tumefaciens物种复合群）、A. radiobacter（原名R. radiobacter）、R. rhizogenes（伞形农杆菌生物变种2/发根农杆菌）和A. rubi是引起冠部和茎部瘿瘤症状的病原菌。最近，在波兰从表现出枝条瘿瘤症状的蓝莓植株中分离到了新的非致瘤性A. vaccinii菌株。典型的伞形农杆菌感染症状包括在根、冠部、茎部甚至花和茎上形成球状或节状瘿瘤。蓝莓瘿瘤病对仍在发育的幼株影响显著，而对老株则不造成严重问题。随着全球范围内不断发现新的伞形农杆菌物种，该属很可能继续扩大。

本研究聚焦于从塞尔维亚伏伊伏丁那地区南部集约化生产的两年级蓝莓植株（品种‘Duke’）上出现的冠瘿病症状样本中分离得到的菌株。初步的16S rRNA序列和多位点序列分析（MLSA）表明，它们可能代表一种独特的、新的伞形农杆菌物种。为了验证这一点，研究人员采用了多相分类学方法，包括基因组序列分析和表型特征鉴定。

主要技术方法

研究人员从出现冠瘿病症状的蓝莓植株（品种‘Duke’）的瘿瘤内部组织分离细菌，获得7个菌株。通过多位点序列分析（MLSA）对5个基因位点（16S rRNA, atpD, dnaK, glnA, rpoB）进行测序和系统发育分析。对代表性菌株BA1120进行全基因组测序（Illumina NovaSeq）、组装和注释，计算其与相关伞形农杆菌模式菌株的平均核苷酸一致性（ANI）。利用特异性PCR检测毒性基因（virD2, ipt, virC）。在蓝莓实生苗（‘Duke’）以及番茄和向日葵幼苗上进行致病性测定。使用API 50 CH系统进行生化特征分析。

结果

表型特征

在D1培养基上生长10天后，从蓝莓样本中分离出的菌落呈圆形、凸起、浅蓝色至深橄榄绿色。接种蓝莓植株（‘Duke’）24天后，接种部位出现球形、白色、海绵状的瘿瘤样结构，并在七周内持续增大。

阴性对照蓝莓植株未观察到症状。接种番茄和向日葵幼苗五周后未观察到致病性。所有蓝莓分离株的生化反应一致。它们在表型上可通过不利用dulcitol和d-tagatose，但利用xylitol，与密切相关的伞形农杆菌物种区分开。

基因型特征

七个塞尔维亚蓝莓分离株在五个基因位点上的序列完全一致。BLASTn分析结果显示，这些分离株不能稳定地匹配到任何一个已知物种。基于五个基因位点串联序列构建的系统发育树表明，这些蓝莓分离株与A. vaccinii、A. rosae和A. rubi的模式菌株聚集在一个分支内，但处于一个独立的位置。

针对三个毒性基因（virD2, ipt, virC1-virC2）的PCR检测结果均为阴性，未扩增出预期大小的片段。

全基因组分析

菌株BA1120的基因组测序结果组装成34个重叠群，总长度为4,963,342 bp，G+C含量为57.5%。基因组注释未发现Ti质粒存在的证据（未检测到典型的毒性基因，且无法比对到Ti质粒的小重叠群总长仅3537 bp）。基于全基因组序列的系统发育分析确认BA1120与A. vaccinii、A. rubi和A. rosae位于同一分支，但其与这些物种模式菌株的ANI值均低于86%（最高为与A. rosae NCPPB 1650^T的85.48%），远低于95%的物种界定阈值。

讨论与结论

本研究通过多相分类学方法，详细描述了从塞尔维亚蓝莓冠瘿病中分离得到的一群细菌菌株。系统发育分析（MLSA和基因组学）一致表明，这些菌株与伞形农杆菌属中的‘rubi’分支（包括A. vaccinii, A. rubi, A. rosae）亲缘关系最近，但在系统发育树上占据一个独立的进化位置。最关键的全基因组平均核苷酸一致性（ANI）分析显示，其与所有已知伞形农杆菌物种模式菌株的ANI值均低于86%，这为将其界定为新物种提供了强有力的基因组学证据。此外，独特的表型特征（如对dulcitol, d-tagatose, xylitol的利用差异）进一步支持了其分类学上的独特性。

一个值得深入探讨的发现是，尽管这些分离株在蓝莓植株上能诱导产生瘿瘤样结构，但基因组分析和特异性PCR检测均未发现其携带典型的肿瘤诱导（Ti）质粒或常见的毒性基因（virD2, ipt, virC）。这与先前报道的非致病性A. vaccinii相似，但后者并未在蓝莓上引起瘿瘤。这种“无Ti质粒却致瘿”的现象提出了关于其致病机制的新问题。研究人员在BA1120基因组中注释出三个可能与毒力相关的基因，分别编码AcvB/VirJ家族赖氨酰磷脂酰甘油水解酶、YihY/BrkB家族毒力因子蛋白和植物毒力效应因子HPE1样结构域蛋白。这些基因的功能在伞形农杆菌中尚未完全阐明，但它们可能通过影响细菌与植物的互作，以不依赖于经典T-DNA转移的机制参与瘿瘤的形成。此外，水平基因转移可能使菌株获得新的毒力因子，也可能是植物应激反应模拟了肿瘤症状。这一发现挑战了对伞形农杆菌致病性 solely 依赖于Ti质粒的传统认知，揭示了其致病机制的潜在多样性，为未来研究指明了方向。

综上所述，本研究基于充分的基因型和表型证据，提议将这些塞尔维亚蓝莓分离株归为伞形农杆菌属的一个新物种，并命名为Agrobacterium vacciniicorymbosi sp. nov.，指定BA1120^T (NCPPB 4800=CFBP 9290)为模式菌株。该新种的发现不仅丰富了伞形农杆菌属的物种多样性，加深了对该属细菌进化关系的理解，而且为蓝莓冠瘿病的病原鉴定和防控提供了重要的基础资料。其不依赖经典Ti质粒而可能诱导植物产生瘿瘤样结构的特性，为研究细菌-植物互作和病原体进化提供了新的视角和材料。