氯喹通过抑制自噬增强凋亡：HMGB1介导的营养剥夺下人髓核细胞命运调控机制研究

《Scientific Reports》：HMGB1 mediated autophagy and apoptosis in human nucleus pulposus cells; chloroquine amplified apoptosis by inhibiting autophagy

本研究针对椎间盘退变（IVDD）中髓核（NP）细胞在营养剥夺下的存活机制，探讨了高迁移率族蛋白B1（HMGB1）在调控自噬与凋亡平衡中的关键作用。研究人员通过体外模拟营养缺失环境，发现血清剥夺可时间依赖性激活HMGB1介导的自噬通路（LC3-II↑/P62↓），但持续应激会促使细胞转向凋亡（cleaved caspase-3↑）。氯喹（CQ）抑制自噬流后显著加剧凋亡，揭示自噬在应激早期起保护作用。该研究为IVDD的靶向治疗提供了新思路。

在成年人群体中，颈腰痛已成为严重影响生活质量的主要健康问题，而其重要病因之一便是椎间盘退变（IVDD）。作为脊柱中最大的无血管组织，椎间盘通过软骨终板从邻近椎体扩散获取氧气和葡萄糖等营养物质。然而随着年龄增长、机械负荷、损伤或终板钙化等因素，这一精妙的营养供应链极易被破坏，导致髓核（NP）细胞陷入缺氧和营养匮乏的微环境。在这种应激状态下，细胞如何维持生存？又会走向怎样的命运？这成为理解IVDD发生机制和探索治疗策略的核心科学问题。

近日发表在《Scientific Reports》的一项研究，聚焦于人髓核（HNP）细胞在营养剥夺条件下的应激反应。研究人员发现，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）作为关键分子开关，动态调控着自噬与凋亡的平衡。在血清剥夺早期，HMGB1从细胞核转移至胞质，通过激活Beclin-1促进自噬流，帮助细胞清除受损组分以维持稳态；但随着应激持续，HMGB1同时参与推动细胞走向caspase-3依赖的凋亡途径。更引人注目的是，当使用自噬抑制剂氯喹（CQ）干预后，细胞凋亡显著加剧，提示抑制自噬可能加速IVDD进程。这一发现不仅深化了对椎间盘退变细胞机制的理解，也为靶向调控自噬-凋亡平衡的治疗策略提供了重要实验依据。

为深入揭示这一机制，研究团队采用多学科技术手段：从人生物样本库获取髓核组织进行原代细胞培养，在模拟生理低氧（5% O₂）条件下通过血清浓度梯度（0%-10% FBS）构建营养剥夺模型。通过Western Blot（WB）检测LC3-II/P62/HMGB1/cleaved caspase-3等关键蛋白表达，免疫荧光（IF）观察蛋白定位与表达，流式细胞术（FACS）定量凋亡细胞比例，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析基因转录水平，并结合细胞形态学、脱氢酶活性（CCK-8）和DNA含量测定等多指标综合评价细胞状态。

Diminished serum and nutrient levels: impacts on NP cell proliferation and metabolic function

研究显示，降低血清浓度会导致HNP细胞形态皱缩、数量减少。在HBSS（Hank's平衡盐溶液）中培养48小时后，细胞几乎完全脱落。脱氢酶活性和DNA含量测定表明，血清剥夺不仅抑制细胞增殖，还显著降低代谢活性。在DMEM-F12培养基中，10% FBS条件下细胞代谢活性最高，而0-1% FBS组代谢功能急剧下降，证实营养可用性对维持NP细胞稳态至关重要。

Reduced serum and nutrients increase NP cellular autophagy

Western Blot分析揭示，在0%和1% FBS条件下，LC3-II表达在48小时达到峰值，且LC3-II/LC3-I比值显著升高，同时自噬底物P62降解明显，表明自噬流被激活。HMGB1表达随血清浓度降低而增加，且呈现时间依赖性胞质转位。免疫荧光染色进一步验证LC3阳性斑点在高浓度血清下减少，而P62阳性信号增强。RT-qPCR显示LC3 mRNA表达上调，P62 mRNA下调，从转录水平确认自噬激活。

特别值得注意的是，氯喹（CQ）处理导致所有血清条件下LC3-II积累，证实其通过抑制自噬体-溶酶体融合阻断自噬流。这为后续观察CQ加剧凋亡提供了机制解释。

Reduced serum concentration increases HNP cellular caspase-dependent apoptosis

凋亡指标显示，cleaved caspase-3蛋白在0% FBS条件下表达最高，且随血清浓度增加而递减。免疫荧光显示核cleaved caspase-3阳性细胞比例在血清剥夺条件下显著升高。流式细胞术检测凋亡细胞比例（Annexin V⁺）在0% FBS组达到峰值。RT-qPCR结果同步显示caspase-3 mRNA表达上调。这些结果一致表明血清剥夺诱导caspase依赖的凋亡途径。

尤为关键的是，当研究人员联合使用CQ与血清剥夺处理时，cleaved caspase-3表达较单纯血清剥夺组升高2-3倍，证明自噬流抑制会显著放大凋亡信号。

综合讨论表明，HMGB1在营养应激下扮演着双重角色：早期通过促进自噬发挥保护作用，持续应激则导向凋亡。这种动态平衡的打破可能是IVDD进展的重要机制。氯喹通过抑制自噬流加剧凋亡的现象，一方面证实自噬在应激条件下的保护功能，另一方面也警示临床使用自噬抑制剂可能加速椎间盘退变风险。

该研究首次系统阐释了HMGB1在营养剥夺条件下调控HNP细胞自噬-凋亡转换的分子时序，为理解IVDD病理进程提供了新视角。研究结果提示，针对HMGB1通路的精准调控（如增强保护性自噬或阻断其促凋亡作用）可能成为延缓椎间盘退变的新策略。未来研究可结合HMGB1基因操作工具进一步验证其分子开关功能，并探索其与炎症反应、氧化应激等机制的交叉对话，为开发IVDD的病理阶段适应性治疗提供理论依据。