5-甲酰胞苷并非哺乳动物细胞中普遍存在的RNA修饰：重新评估f5C的表观转录组学功能

《Nature Communications》：5-Formylcytosine is not a prevalent RNA modification in mammalian cells

本研究针对哺乳动物RNA中5-甲酰胞苷(f5C)修饰的真实存在与分布提出质疑。为解决传统化学测序方法特异性不足的问题，研究人员开发了FIBo-seq高特异性测序技术，结合LC-MS/MS分析和mt-tRNAMet杂交捕获实验，系统评估了f5C在小鼠胚胎干细胞中的修饰情况。结果表明，除线粒体tRNAMet(mt-tRNAMet)上已知的f5C34位点外，哺乳动物细胞mRNA中并未检测到显著的f5C修饰，且TET酶在体内不参与f5C形成。该研究澄清了领域内对f5C功能的认知，为表观转录组学研究提供了方法学借鉴。

　　

在表观转录组学快速发展的今天，RNA修饰研究领域正经历着深刻的变革。5-甲酰胞苷(f5C)作为一种备受关注的RNA修饰，曾被报道存在于多种生物的mRNA中，暗示其可能具有重要的基因调控功能。然而，这一领域面临着严峻的挑战：检测技术的特异性不足可能导致对f5C真实存在情况的误判。低丰度的f5C修饰（在ppm级别）究竟代表着真实的生物学信号，还是仅仅是实验假象？这个问题一直困扰着研究人员。

以往的研究使用吡啶-硼烷(PyBo)等化学测序方法，在酵母、小鼠和人类细胞中报告了数以千计的f5C位点。但德国分子生物学研究所(IMB)的Jasmin A. Dehnen、Alexander V. Gopanenko等研究人员对这些结果的可靠性提出了质疑。他们发现，传统的PyBo测序方法存在严重的特异性问题——不仅与N4-乙酰胞苷(ac4C)发生交叉反应，还会误将未修饰但高反应性的胞苷识别为f5C。这种情况在CUMC序列背景中尤为明显。

为了澄清f5C在哺乳动物细胞中的真实分布情况，并评估TET酶在f5C形成中的作用，研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新发现。他们采用了一种多维度的研究策略，结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)和化学辅助测序技术，对小鼠胚胎干细胞(mESCs)中的f5C进行了全面分析。

关键技术方法包括：开发高特异性f5C测序技术FIBo-seq（结合免疫沉淀和吡啶-硼烷处理），利用LC-MS/MS进行精确修饰定量，建立mt-tRNAMet杂交捕获技术以特异性去除目标转录本，以及通过体外转录RNA验证PyBo反应特性。研究使用了野生型、Alkbh1基因敲除和Tet1/2/3三基因敲除的mESCs模型，并扩展至NIH/3T3、C2C12、HeLa和HEK293T等细胞系进行验证。

PyBo-seq揭示ALKBH1和TET非依赖性的假性f5C位点

研究人员首先使用PyBo-seq技术在mESCs转录组中绘制f5C图谱。尽管在阳性对照mt-tRNAMet的f5C34位点成功检测到ALKBH1依赖性的C-to-T转换，但在全转录组范围内却发现了大量ALKBH1和TET非依赖性的C-to-T位点。这些位点缺乏已知m5C修饰的序列特征，且与已报道的m5C位点没有重叠。

Mal-seq未能验证mESC RNA中的假性f5C位点

为验证PyBo-seq结果的特异性，研究团队测试了多种化学试剂对修饰胞苷的反应性。发现PyBo不仅与f5C反应，还与ac4C和ca5C发生交叉反应。而丙二腈(Mal)表现出更好的特异性。然而，全转录组Mal-seq分析显示，除了mt-tRNAMet的f5C34位点外，未能重复PyBo-seq中发现的其他C-to-T位点。

FIBo-seq在RNA f5C分析中展现出卓越的特异性和灵敏度

为解决PyBo-seq的特异性问题，研究人员开发了FIBo-seq技术，该技术通过f5C抗体富集后再进行PyBo-seq分析。这种方法对mt-tRNAMet中f5C34位点的检测灵敏度极高（C-to-T转换率达98%），但在全转录组范围内仍未发现新的f5C位点。

去除mt-tRNAMet后哺乳动物细胞转录组中的f5C信号消失

LC-MS/MS分析显示，mESCs总RNA中f5C水平仅为2-7 ppm，且全部依赖于ALKBH1。通过杂交捕获技术特异性去除mt-tRNAMet后，f5C信号完全消失，而mRNA组分中未检测到f5C。这一现象在小鼠和人类多种细胞系中得到验证。

吡啶硼烷在暴露的CUMC基序中与未修饰胞苷诱导C-to-T位点

序列分析发现，PyBo诱导的C-to-T位点富含CUMC（M为A或C）基序，且这些位点通常位于预测的RNA环区。通过体外转录实验证实，未修饰但处于特定结构环境中的胞苷对PyBo具有高反应性。

研究结论表明，哺乳动物细胞中的f5C基本上局限于mt-tRNAMet，主要由ALKBH1催化形成，而TET酶在体内不参与f5C生成。此前基于PyBo-seq的研究因方法学局限性高估了f5C的分布范围。该研究不仅澄清了f5C在哺乳动物中的生物学意义，还为表观转录组学领域提供了重要的方法学借鉴——强调在解读化学测序数据时需谨慎考虑技术特异性问题。FIBo-seq作为一项高特异性技术，未来可用于在其他生物中准确分析f5C修饰。同时，PyBo高反应性CUMC位点的发现，提示这些位点可能具有独特的化学性质，如pKa值偏移的胞苷，在核酶和核糖开关中发挥重要功能。