综述：NLRP3的翻译后修饰：启动与否？

《TRENDS IN Immunology》：Post-translational modifications of NLRP3: to prime or not to prime?

本综述由哈佛医学院专家撰写，系统阐述了NLRP3炎症小体激活的关键“启动”步骤。文章聚焦于超越传统转录调控的多种翻译后修饰（如泛素化、磷酸化、棕榈酰化等），深入分析了这些修饰如何精密调控NLRP3的稳定性、亚细胞定位及蛋白质相互作用，从而决定其功能状态。该文为选择性抑制NLRP3病理活性同时保留宿主防御功能提供了新的理论依据和潜在治疗靶点。

　　

NLRP3炎症小体：一个受到精密调控的蛋白质复合物

炎症小体是属于核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体（NLR）家族的模式识别受体（PRRs），是由多种蛋白质形成的超分子复合物（SMOCs），作为激活前炎性caspase-1的支架。一旦激活，caspase-1将前体形式的促炎细胞因子白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-18（IL-18）切割成其成熟的、具有生物活性的形式。同时，caspase-1切割消皮素D（GSDMD），释放其N端结构域，该结构域插入质膜形成孔道。GSDMD孔道使得IL-1β、IL-18和其他危险相关分子模式（DAMPs）的分泌成为可能，并最终引发焦亡——一种高度促炎的细胞死亡形式，以NINJ1依赖的细胞裂解告终。在NLRs中，包含NACHT结构域、富含亮氨酸重复序列（LRR）和pyrin结构域（PYD）的蛋白3（NLRP3）炎症小体在过去二十年中引起了广泛关注，因为它与多种疾病相关。

NLRP3的功能发挥需要两个连续的信号：一个“启动”信号（或信号1）和一个“激活”信号（或信号2）。

启动信号由通过PRRs（如Toll样受体TLRs）发出信号的病原体相关分子模式（PAMPs）或由促炎细胞因子通过IL-1受体（IL-1R）或肿瘤坏死因子（TNF）受体（TNFR）传递。历史上，这一步骤曾被认为主要是驱动在髓系细胞中稳态下低水平表达的NLRP3以及前体IL-1β（pro-IL-1β）的转录上调。值得注意的是，进一步的分析表明，启动信号对于诱导NLRP3的非转录调控也是必要的，这对于其在感知信号2后的组装和激活至关重要。实际上，NLRP3受到翻译后修饰的严格调控，这些修饰决定了其亚细胞定位、构象、蛋白质稳定性以及与结合伙伴的相互作用。在启动状态下，NLRP3在高尔基体网络（TGN）处寡聚化成由12至16个单体组成的双环笼状结构，这些单体通过其LRR结构域在面对面和背对背的界面相互作用。这种构象将NLRP3的PYD结构域保持在笼腔内部，避免了NLRP3衔接蛋白ASC的成核和caspase-1的募集。启动被定义为一系列转录和翻译后事件的总和，这些事件对于在检测到激活信号时许可NLRP3组装成功能性炎症小体SMOC是必需的。一旦启动，NLRP3就变得能够响应各种微生物毒力因子或宿主来源的DAMPs。激活步骤最近已被深入综述，但总的来说，尽管NLRP3属于PRR家族，其激活剂的多样性表明NLRP3并不直接识别每种触发因子共有的特定模式。相反，NLRP3激活剂汇聚于NLRP3感知的常见细胞扰动。

超越转录：翻译后启动的发现

在NLRP3被鉴定为ATP传感器之前，就已确定巨噬细胞需要用脂多糖（LPS）等PAMP预处理数小时才能使得caspase-1在响应细胞外ATP时被激活。这一发现证明先天免疫细胞需要一个准备步骤才能对NLRP3触发因子产生响应。NLRP3激活的这一第一步，称为“启动”，最初被认为纯粹是NLRP3的转录上调。NLRP3的转录启动主要通过PRR或TNFR/IL-1R依赖的核因子κB（NF-κB）激活发生，尽管AP-1和Sp1也参与其中。在这种背景下，新蛋白质的合成已被证明是后续NLRP3和caspase-1激活的先决条件。确实，尽管NLRP3在巨噬细胞中稳态下表达，但通过PRRs检测PAMP会诱导NF-κB依赖的NLRP3蛋白以及前体IL-1β水平的上调。相应地，在永生化巨噬细胞中异位表达NLRP3足以许可炎症小体在响应ATP或尼日利亚霉素时激活，从而绕过启动步骤。然而，在这种情况下，LPS预处理仍然能增强NLRP3的激活，这突显了启动的作用超越了NLRP3的转录上调。与此一致的是，多个研究组证明，用TLR激动剂或IL-1β（而非TNF）进行短时间刺激（在信号2之前0至30分钟）可以作为独立于基因转录的“快速”启动信号。值得注意的是，尽管TLRs、IL-1R和TNFR信号都激活NF-κB，但只有TLRs和IL-1R利用IL-1受体相关激酶（IRAK）1-IRAK4-TRAF6轴，这是快速启动所必需的。这是一个值得注意的观察结果，它将NLRP3的上调（在TLR刺激后2小时内不会发生）与其非转录启动分离开来。然而，为什么阻断蛋白质合成会阻止长时间而非短时间暴露于TLR激动剂后NLRP3的功能，这仍然是一个悬而未决的问题。不管这种差异如何，独立于其基因转录的NLRP3启动导致了通过泛素化调控NLRP3活性的首次描述。NLRP3在稳态下被泛素化，并在TLR4快速接合后发生去泛素化，这是后续ATP激活所必需的。这项早期研究导致了非转录启动的识别，后来被称为NLRP3的“翻译后启动”。

除了翻译后启动，在人类中，NLRP3也可以通过选择性剪接进行转录后调控。无法组装成炎症小体的NLRP3变体，如△外显子4和△外显子5。有趣的是，虽然LPS启动增加了全长NLRP3的表达，但干扰素-β暴露被报道有利于△外显子4的表达。同时，microRNAs已被证明负向调控NLRP3的表达。

尽管NLRP3在启动和激活步骤中都受到翻译后修饰的调控，本综述重点关注与启动阶段发生的NLRP3稳定性、定位和蛋白质-蛋白质相互作用相关的修饰。

通过启动稳定NLRP3

为避免不适当的激活，NLRP3蛋白水平受到严格控制，多种E3泛素连接酶和小泛素样修饰（SUMO）连接酶，如MARCH7、FBXL2或线粒体锚定蛋白连接酶（MAPL），已被鉴定为靶向NLRP3进行蛋白酶体降解。然而，SUMO化提供了一个双重调控的例子。虽然MAPL的SUMO化促进NLRP3的蛋白酶体降解，但E3连接酶三重基序包含蛋白28（TRIM28）在LPS启动时用SUMO1、SUMO2和SUMO3对NLRP3进行SUMO化，阻止NLRP3泛素化和后续的蛋白酶体降解。TRIM28靶向的特定赖氨酸残基仍有待确定，SUMO化和泛素化是否竞争同一站点也不清楚。泛素化也可能具有双重效应，E3泛素连接酶TRIM50已被证明在LPS启动时与NLRP3相互作用并有助于其稳定，尽管具体机制尚不清楚。

除了直接调控NLRP3表达，启动还重编程细胞代谢，影响NLRP3稳定性。例如，NLRP3在赖氨酸K21、K22和K24（小鼠中）上的乙酰化是NLRP3活性所必需的。在静息细胞中，NLRP3被去乙酰化酶SIRT1和SIRT3去乙酰化。启动时，不仅NLRP3上调，代谢酶如磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）也被诱导，PHGDH使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）进行丝氨酸合成，产生NADH。PHGDH诱导的NADH积累抑制SIRT1和SIRT3，从而增加NLRP3的乙酰化。值得注意的是，NLRP3在K21、K22和K24上的乙酰化保护该受体免受泛素化和后续降解。一项补充研究表明，赖氨酸乙酰转移酶5（KAT5）在感知激活剂（如尿酸钠晶体、ATP或咪喹莫特）时乙酰化NLRP3的K24。在启动和激活期间是否有多种乙酰转移酶调控NLRP3，以及乙酰化是否直接与泛素化竞争，仍然是悬而未决的问题。

在LPS启动时，E3连接酶β-转导蛋白重复包含蛋白1（β-TrCP1）用K27连接的泛素链修饰NLRP3的K380（小鼠中）以促进其降解。同时，TLR的接合增强Yes相关转录调节因子1（YAP1）的表达，YAP1与NLRP3相互作用并与β-TrCP1竞争，从而稳定NLRP3。

最后，TRIF相关的TLRs（如TLR3和TLR4）的接合诱导干扰素的产生，从而导致干扰素刺激基因（ISGs）如ISG15的诱导。长时间的LPS启动诱导ISG15及其E3连接酶HERC5（人类中）和HERC6（小鼠中）的表达。HERC5在K799（人类中）上对NLRP3进行ISG化，这保护NLRP3免受K48连接的多聚泛素化和蛋白酶体降解。干扰素信号在NLRP3调控中的作用仍未完全了解，并且可能具有情境依赖性，因为其他研究报道了ISGs对NLRP3的抑制作用。值得注意的是，衣康酸是由ISG乌头酸脱羧酶1（ACOD1）合成的代谢物，在长时间LPS启动后抑制炎症小体激活。从机制上讲，衣康酸衍生物4-辛基-衣康酸烷基化NLRP3的C548（小鼠中），这被认为可抑制NLRP3-NEK7相互作用，而内源性衣康酸修饰GSDMD的C77（小鼠中）以阻断焦亡。总的来说，这些发现证明了翻译后修饰在决定NLRP3蛋白水平方面所起的关键作用。

通过启动决定NLRP3的亚细胞定位

NLRP3与多种亚细胞区室相关，包括细胞质、线粒体、内质网（ER）、TGN、内体和MTOC。在静息细胞中，NLRP3主要位于细胞质，但启动后，它被募集到TGN，在那里形成双环笼状结构。在积累到TGN之前，有研究表明NLRP3会短暂定位到线粒体。激活信号触发ER-内体和TGN-内体运输的中断，导致PI4P在内体上积累。NLRP3与内体的结合使其能够运输到MTOC，在那里它可以与NEK7相互作用并形成活性炎症小体盘。因此，NLRP3在TGN的积累是其后续运输到MTOC的先决条件，后者进而允许炎症小体组装。

NLRP3与TGN的结合依赖于一个富含赖氨酸的多碱性序列（人类NLRP3中的残基127-146），这有助于其募集到富含PI4P的膜上。尽管这是必要的，但该基序不足以将NLRP3定位到高尔基体，表明需要额外的调控修饰来实现NLRP3与膜的稳定结合。

最近的研究强调了NLRP3棕榈酰化（或S-酰化）对于其在启动时富集于TGN的关键作用。多个棕榈酰化位点被描述在启动或激活过程中被修饰。启动期间TLRs的接合不仅将巨噬细胞代谢转向糖酵解，还增强了脂肪酸合成。值得注意的是，LPS启动诱导脂肪酸合酶（FASN）的表达以合成棕榈酸，棕榈酸是用于蛋白质半胱氨酸残基棕榈酰化的棕榈酰-CoA的前体。启动期间FASN依赖的NLRP3在C898（小鼠中）上的棕榈酰化是其后续在激活时定位到内体所必需的。同时，启动时锌指DHHC型包含蛋白1（ZDHHC1）介导的NLRP3在C955（小鼠中）上的棕榈酰化促进其定位到线粒体和TGN。C955位于LRR结构域，其棕榈酰化可能稳定了在TGN处双环笼形成过程中一个单体的LRR与相邻单体的螺旋结构域2（HD2）之间的面对面相互作用。

多个研究组报道启动诱导NLRP3在C126（小鼠中；人类中为C130）处的棕榈酰化，这也是募集到TGN所必需的。然而，对于负责C126 S-酰化的棕榈酰转移酶尚未达成共识，因为ZDHHC1、ZDHHC3和ZDHHC7都被涉及，表明可能有多种酶参与。由于C126靠近多碱性区域，有人提出多碱性区域介导NLRP3与膜的瞬时拴系，允许与TGN定位的棕榈酰转移酶相互作用，随后C126的棕榈酰化稳定了NLRP3与膜的锚定。有趣的是，也有报道称在检测到信号2时C126的棕榈酰化增加，这模糊了专门发生在启动或激活期间的事件之间的界限。同时，最近有人提出启动期间ZDHHC7介导的NLRP3 C130和C261（人类中）的棕榈酰化降低了其溶解度，并通过促进由NLRP3激活剂诱导的钾外流引起的液-液相分离来许可NLRP3激活。有趣的是，最近一项研究描述，将NLRP3拴系到MTOC或通过将其与凝聚体形成的TAR DNA结合蛋白43（TDP43）融合来触发其相分离，足以在LPS启动的巨噬细胞中激活炎症小体。

控制巨噬细胞中NLRP3的大多数调控节点在小鼠和人类之间是保守的。通过研究NEK7在人类细胞中的作用，证明表达人类或小鼠NLRP3的人类巨噬细胞可以独立于NEK7组装炎症小体，而NLRP3活性在小鼠巨噬细胞中主要依赖于NEK7。这一发现表明NEK7并非小鼠NLRP3固有必需，相反，它是在不同物种的细胞中NLRP3功能所必需的。在人类细胞中，抑制性κB激酶β（IKKβ）的激酶活性在将NLRP3募集到TGN的富含PI4P的膜上起着基础性作用，这足以绕过对NEK7的需求。IKKβ是直接磷酸化NLRP3还是调控一个将NLRP3募集到TGN所必需的中间蛋白仍有待确定。这种IKKβ依赖的翻译后启动是人类巨噬细胞中的主要机制，但也可以发生在小鼠巨噬细胞中。特别是在组成性表达NLRP3的小鼠永生化巨噬细胞中，尼日利亚霉素足以通过需要NEK7的机制驱动炎症小体的活性，而同时暴露于LPS和尼日利亚霉素数小时则通过IKKβ并独立于NEK7来控制NLRP3。Caspase-8，先前已被证明在NLRP3启动中起作用，是在小鼠巨噬细胞中绕过NEK7所必需的。然而，同样在这种情境下，尽管NEK7并非绝对必要，但它能增强炎症小体的激活。有趣的是，大肠杆菌毒素CNF1对Ras相关C3肉毒毒素底物2（RAC2）的激活足以启动并激活NLRP3。在这种情境下，RAC2的激活支持p21激活激酶1（PAK1）对NLRP3 T659（人类中；小鼠中为T657）的磷酸化，并与NEK7的募集相关。尽管CNF1启动NLRP3的确切机制尚未完全明了，但一种可能性是NLRP3在T659处的磷酸化允许了NEK7依赖的NLRP3启动。这些数据证明了翻译后修饰在控制NLRP3亚细胞定位以及进而其活性方面的重要性。

通过启动促进蛋白质-蛋白质相互作用

除了稳定NLRP3和控制其亚细胞定位外，启动步骤还影响启动和激活步骤中NLRP3的结合伙伴。在静息细胞中，NLRP3在其NACHT和LRR结构域上被混合的K48和K63连接的泛素链多聚泛素化。在启动阶段，NLRP3被c-Jun N末端激酶1（JNK1）在S198（人类中；小鼠中为S194）处快速磷酸化。这种磷酸化促进去泛素化酶BRCA1/BRCA2包含复合物亚基3（BRCC3）的募集，该酶从NLRP3的LRR结构域移除抑制性但非降解性的K63连接泛素链。除了其在启动中的作用，JNK信号还通过促进线粒体ROS生成和NEK7磷酸化来促进NLRP3的激活。同时，Abraxas 2，BRISC复合物亚基1（ABRO1），是BRISC复合物中与BRCC3同属的成员，以磷酸化S198依赖的方式被募集到NLRP3。ABRO1通过防止E3连接酶WWP2对BRCC3的降解性泛素化来促进BRCC3的稳定性。此外，NLRP3在启动期间被酪蛋白激酶I亚型α（CSNK1A1）在S806（人类中）处磷酸化。在检测到激活刺激时，该残基的去磷酸化是BRCC3募集所必需的。这些受到严格调控的事件保证了BRCC3在检测到激活信号时可用于去泛素化NLRP3，并突显了动态磷酸化/去磷酸化事件对于NLRP3功能发挥的必要性。重要的是，JNK1-BRCC3轴已被描述在Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2（TET2）介导的克隆性造血背景下促进NLRP3炎症小体激活，从而促进动脉粥样硬化的发展。

启动步骤也调控NLRP3-NLRP3相互作用。启动期间由Msn样激酶1（MINK1）对NLRP3 LRR结构域S728（人类中）的磷酸化被认为可促进NLRP3的自关联。然而，S728是特异性促进NLRP3寡聚化以形成双环笼还是用于组装活性炎症小体盘，仍有待确定。

在启动期间，NLRP3的PYD结构域在S5（人类中；小鼠中为S3）处被AKT丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化，这保护NLRP3免受TRIM31在K496（人类中）处的降解性泛素化。此外，这种磷酸化通过诱导PYD结构域的静电排斥来防止NLRP3的不适时寡聚化。在检测到激活信号时，NLRP3 S5被蛋白磷酸酶2A（PP2A）去磷酸化，从而允许PYD-PYD相互作用和炎症小体盘的形成。在启动期间，布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）磷酸化PP2A以抑制其磷酸酶活性，避免S5的过早去磷酸化。同时，在TLR激活的下游，TANK结合激酶1（TBK1）和IKKε也通过维持S5的磷酸化来促进这种抑制性磷酸开关，要么直接作用，要么通过激活AKT，从而对抗PP2A的活性。有趣的是，除了其在启动期间的负调控作用外，BTK还通过磷酸化多碱性区域内的Y136、Y140和Y143（人类中）来促进NLRP3激活。通过改变多碱性区域的电荷，这些修饰削弱了NLRP3-PI4P相互作用并促进其从膜上释放，从而允许运输到MTOC进行NLRP3激活。类似地，有描述称蛋白激酶D（PKD）在检测到信号2时磷酸化NLRP3的S295（人类中；小鼠中为S293），以将其从线粒体相关内质网膜释放。令人惊讶的是，蛋白激酶A（PKA）对同一残基的磷酸化，响应于胆汁酸和前列腺素E2（PGE2），却抑制了炎症小体的激活。这些相反的结果表明S295的磷酸化是NLRP3调控中的一个动态事件。

在TLR和IL-1R信号的下游，IRAK1在快速启动期间是NLRP3激活所必需的。相比之下，在经典的长时启动期间，IRAK1通过阻止NLRP3的K63连接多聚泛素化和与Pellino 2（PELI2）的结合来负向调控NLRP3，而PELI2间接促进NLRP3泛素化以启动NLRP3。这些发现突显了正负调控NLRP3启动和激活的修饰之间相互作用的复杂性。