利用质谱成像技术，探究在诱导群集运动的条件下铜绿假单胞菌次级代谢产物的空间分布规律

《Microbiology Spectrum》：Insights on the spatial distribution of the Pseudomonas aeruginosa secondary metabolites under swarming motility-inducing conditions using mass spectrometry imaging

枯草芽孢杆菌趋动性代谢物空间分布及外源拉曼脂质影响研究。采用优化质谱成像（MSI）技术，发现0.5%琼脂半固体培养基中PQS/HQNO、酸性吡嗪（PYO）和Rha-Rha-C10-C10等代谢物在菌丝间呈梯度分布，且外源添加拉曼脂质（0.0001-1 mg/mL）浓度依赖性抑制趋动行为，并改变代谢物分泌模式。研究建立了一种适用于大尺寸趋动菌落（>1 cm）的MSI样本制备流程，为解析生物膜形成机制提供新方法。

　　Pseudomonas aeruginosa 是一种广泛存在于自然环境中的革兰氏阴性菌，它在多种条件下展现出不同的运动形式，包括 twitching（颤动）、swimming（游泳）和 swarming（漫游）。这些运动方式不仅反映了细菌的生理特性，也对它们在宿主环境中的生存和致病能力具有重要意义。其中，swarming 动态在某些特定的生长条件下尤为显著，例如在半固体表面（如0.4%至0.5%的琼脂）上，细菌能够形成扩展的触须结构，并分泌一系列次级代谢产物。这些代谢产物不仅有助于细菌在表面的扩散，还在病原体的致病机制中扮演重要角色。为了深入理解这些代谢产物在细菌漫游行为中的作用，研究人员开发了一种基于质谱成像（Mass Spectrometry Imaging, MSI）的技术，用于分析 P. aeruginosa 在漫游状态下的化学特征，并探讨外部添加的 rhamnolipids（鼠李糖脂）如何影响其运动行为和次级代谢产物的分泌。

Rhamnolipids 是一种由 P. aeruginosa 分泌的生物表面活性剂，它们通过降低液体表面张力，帮助细菌在半固体环境中快速扩散。尽管 rhamnolipids 在漫游过程中起到积极作用，但本研究发现，当这些物质被外部添加到漫游培养基中时，它们的浓度依赖性效应可能导致细菌运动行为的显著变化。具体而言，即使在较低浓度下，添加的 rhamnolipids 也表现出对细菌漫游行为的抑制作用，这与细菌自身产生的 rhamnolipids 所发挥的促进作用形成鲜明对比。这一发现提出了一个有趣的问题：为什么在漫游过程中，细菌的触须会避免重叠？这可能与 rhamnolipids 的空间分布和其对细胞间相互作用的调节有关。通过 MSI 技术，研究人员能够观察到 rhamnolipids 在细菌扩散过程中的扩散模式，以及它们如何影响其他次级代谢产物的分布。这种空间化学分析不仅有助于揭示细菌的代谢网络，还可能为开发新的抗菌策略提供线索。

此外，P. aeruginosa 的漫游行为还涉及其他重要的次级代谢产物，如 quinolones（喹啉酮类化合物）和 phenazines（苯并二氮杂?类化合物）。其中，quinolones 是 P. aeruginosa 的群体感应（quorum sensing）系统中的关键信号分子，它们通过调控基因表达，影响细菌的群体行为和致病能力。PQS（Pseudomonas quinolone signal）是最常见的 quinolone 之一，它在漫游过程中具有特定的分布模式，通常集中在细菌生长区域的中心。而 phenazines，如 pyocyanin（绿脓菌素）和 pyochelin（铜绿假单胞菌素），则在漫游过程中表现出不同的分布特性。例如，pyocyanin 在酸性条件下可能具有不同的功能，如诱导氧化应激和细胞毒性，而在中性或碱性条件下则可能发挥其他作用。这些次级代谢产物的分布不仅反映了细菌的代谢状态，还可能与细菌在宿主组织中的适应性有关。

为了更全面地研究这些代谢产物的空间分布，研究人员优化了 P. aeruginosa 漫游培养的条件，包括培养基成分、琼脂浓度和培养时间。经过多次实验，他们发现使用 M8 最小培养基（含 0.5% 琼脂）并加入特定浓度的 MgSO?、CaCl?、葡萄糖和 Casamino 酸，能够促进细菌形成结构清晰、细胞密度均匀的触须。这种优化不仅提高了 MSI 分析的准确性，还确保了实验的可重复性。在实际操作中，研究人员需要特别注意培养基的转移和干燥过程，以避免对细菌生长造成干扰。例如，使用加热而非强制空气干燥的方法，可以实现更均匀的干燥效果，同时减少对细菌代谢产物的损失。

MSI 技术的应用使得研究人员能够以非破坏性的方式观察细菌在漫游过程中的代谢产物分布。通过将整个琼脂培养基转移到 MALDI 目标板上，并使用 MALDI-2 仪器进行分析，他们能够获得详细的化学图像，揭示细菌在不同环境下的代谢变化。此外，该技术还能够区分不同种类的代谢产物，例如 rhamnolipids、quinolones 和 phenazines，并展示它们在细菌生长区域内的分布模式。研究还发现，某些 rhamnolipids，如 Rha-Rha-C10-C10 和 Rha-C20，不仅在细菌生长区域内部积累，还会扩散到琼脂表面，形成特定的化学信号。这些信号的分布可能与细菌的扩展能力和环境适应性有关。

通过将不同浓度的 rhamnolipid 混合物加入培养基中，研究人员进一步探讨了这些物质对细菌漫游行为的影响。结果显示，当 rhamnolipid 浓度超过一定阈值时，细菌的触须结构会逐渐消失，甚至完全停止扩展。这一现象表明，rhamnolipids 在低浓度时可能促进细菌的运动，而在高浓度时则可能抑制其扩散能力。这种浓度依赖性的效应可能与细菌的群体感应机制有关，因为高浓度的 rhamnolipids 可能会干扰细菌的信号传导，从而影响其行为模式。同时，研究还发现，rhamnolipid 的添加改变了其他代谢产物的分布，如 PQS 和 pyocyanin，这进一步表明 rhamnolipids 在细菌代谢网络中的复杂作用。

研究还揭示了 MSI 技术在分析细菌漫游行为方面的优势。相比传统的化学提取或细胞裂解方法，MSI 能够在不破坏细菌样本的情况下，直接观察其在培养基表面的化学分布。这种非侵入性方法不仅保留了细菌的自然状态，还能够提供更精确的空间信息。例如，通过 MSI 分析，研究人员能够识别出某些代谢产物在特定区域的富集，这可能与细菌的运动方向或环境适应性有关。此外，MSI 还可以用于比较不同实验条件下的代谢产物分布，从而帮助研究人员理解细菌在不同环境中的行为变化。

尽管 MSI 技术在细菌研究中展现出巨大潜力，但其应用也面临一些挑战。例如，干燥过程可能影响某些挥发性代谢产物的检测，而激光离子化可能会导致样本的局部破坏。此外，长期数据采集过程中，仪器的响应可能会发生变化，影响结果的可比性。为了解决这些问题，研究人员建议采用较低空间分辨率进行初步筛查，并在感兴趣区域进行高分辨率分析。同时，他们还强调了样本制备和数据采集的一致性，以确保实验结果的可靠性。

总的来说，这项研究通过优化培养条件和样本制备流程，结合 MSI 技术，深入探讨了 P. aeruginosa 在漫游过程中的代谢产物分布及其与运动行为之间的关系。研究结果不仅揭示了 rhamnolipids 在细菌扩散中的复杂作用，还为理解细菌在宿主环境中的适应性提供了新的视角。此外，该研究还展示了 MSI 技术在细菌研究中的应用价值，特别是在分析空间化学特征和探索代谢产物功能方面。随着技术的不断发展，MSI 有望成为研究细菌行为和开发新型抗菌策略的重要工具。