通过极端嗜热微生物Deinococcus radiodurans R1的定向代谢工程，实现未精炼甘油的微生物升级转化生成β-胡萝卜素

《Bioresource Technology》：Microbial upcycling of unrefined glycerol to beta-carotene by tailored metabolic engineering of extremophilic microorganism Deinococcus radiodurans R1

利用未精制甘油通过代谢工程改造德氏雷 fitting R1菌株生产β-胡萝卜素，通过过表达crtY、删除crtLm和crtO基因构建基础菌株，进一步整合glpK、glpD和tpiA基因优化甘油代谢， fed-batch发酵中实现27.23 mg/L产量，较葡萄糖和基础菌株分别提高3倍和33.2倍。

　　本研究聚焦于利用一种名为 *Deinococcus radiodurans* R1 的极端微生物，将其改造为一种高效的生物催化剂，用于从未经提纯的甘油中生产β-胡萝卜素。β-胡萝卜素是一种重要的天然色素，广泛应用于食品、化妆品和医药行业。传统的β-胡萝卜素生产通常依赖于高纯度的甘油作为碳源，但这种提纯过程成本高昂且环境负担较大。因此，如何在不依赖提纯的前提下，直接利用未经提纯的甘油进行β-胡萝卜素的高效生产，成为当前生物技术领域的重要课题之一。

*Deinococcus radiodurans* R1 是一种具有强大抗辐射和抗氧化能力的极端微生物，能够在高毒性环境中存活并维持正常的代谢功能。这种特性使其成为一种理想的宿主菌，用于开发能够耐受工业副产物中杂质的生物转化系统。本研究的核心目标是通过基因工程手段，优化 *D. radiodurans* R1 的代谢途径，使其能够高效地将未经提纯的甘油转化为β-胡萝卜素，从而为可持续的生物精炼工艺提供新的解决方案。

为了实现这一目标，研究人员首先构建了一个基础菌株，通过基因操作完成β-胡萝卜素的合成路径。β-胡萝卜素的合成通常涉及一系列酶促反应，其中关键步骤包括从异戊烯焦磷酸（IPP）合成番茄红素，再通过β-胡萝卜素合成酶将番茄红素转化为β-胡萝卜素。然而，*D. radiodurans* R1 自身并不具备完整的β-胡萝卜素合成路径，特别是在将番茄红素转化为β-胡萝卜素的关键酶——β-胡萝卜素β-环化酶（CrtY）方面存在缺失。因此，研究人员从 *Pantoea agglomerans* 中引入了 *crtY* 基因，并删除了 *crtLm* 基因，以确保合成路径的完整性。这些基因的编辑使得 *D. radiodurans* R1 能够在未经提纯的甘油中实现β-胡萝卜素的稳定生产，初始产量达到了 0.46?±?0.03?mg/L，即 0.10?±?0.01?mg/g DCW。

在基础菌株的基础上，研究团队进一步对代谢路径进行了优化，以提高β-胡萝卜素的产量。其中，删除 *crtO* 基因是关键的一步。*crtO* 基因编码的酶参与了β-胡萝卜素的后续代谢，但在某些情况下，该酶可能对β-胡萝卜素的积累产生抑制作用。因此，通过删除该基因，研究人员能够减少β-胡萝卜素的降解，从而提高其产量。此外，研究团队还对限制性步骤进行了精细调控，通过基因过表达和启动子替换的方式，增强了前体物质的供应能力。这些优化措施使得β-胡萝卜素的产量显著提升，达到了 5.97?±?0.35?mg/L，即 2.03?±?1.03?mg/g DCW，比基础菌株的产量提高了约 33.2 倍。

为了使 *D. radiodurans* R1 能够有效利用未经提纯的甘油作为唯一的碳源，研究人员还对甘油代谢相关基因进行了改造。甘油代谢是β-胡萝卜素合成路径中的一个重要环节，因为β-胡萝卜素的合成依赖于甘油的分解产物——甘油醛-3-磷酸（G3P）和二羟基乙酰磷酸（DHAP）。这些中间产物在细胞内进一步转化为异戊烯焦磷酸（IPP），进而进入β-胡萝卜素合成路径。因此，研究人员引入了 *glpK*、*glpD* 和 *tpiA* 三个关键基因，分别负责甘油的分解、转运以及代谢中间产物的互变。通过这些基因的整合，研究人员成功地使 *D. radiodurans* R1 能够高效地利用未经提纯的甘油，最终实现了 β-胡萝卜素产量的进一步提升，达到 11.56?±?1.03?mg/L，即 2.27?±?0.20?mg/g DCW。这一产量比使用葡萄糖作为碳源的产量提高了约三倍，比基础菌株的产量提高了约 64 倍。

在连续发酵（fed-batch）过程中，研究人员进一步优化了培养条件，以提高β-胡萝卜素的生产效率。通过在发酵过程中逐步添加未经提纯的甘油，研究人员发现最终的工程菌株能够在 102 小时内从 25.45?g/L 的未经提纯甘油中生产出 27.23?mg/L 的β-胡萝卜素，即 2.60?mg/g DCW。这一结果表明，该菌株不仅能够在高浓度的未经提纯甘油中维持正常的生长和代谢活动，还能够在连续发酵过程中实现β-胡萝卜素的高效积累。此外，这种发酵方式相比传统的批次发酵更加经济高效，因为它能够减少培养基的消耗，同时提高产物的浓度和收率。

本研究的创新点在于，它不仅关注于β-胡萝卜素的合成路径优化，还特别强调了如何利用 *D. radiodurans* R1 的天然抗逆特性，使其能够耐受未经提纯甘油中的各种杂质。这些杂质包括残留的甲醇、过氧化物以及脂肪酸盐等，它们可能对细胞膜造成损伤，导致细胞生长受阻或代谢活动下降。然而，*D. radiodurans* R1 的强大抗氧化能力和DNA修复机制使其能够有效应对外部环境的毒性压力，从而保持正常的代谢功能。这种特性使得该菌株成为一种理想的生物催化剂，能够在不依赖复杂提纯工艺的情况下，直接利用未经提纯的甘油进行β-胡萝卜素的生产。

在实际应用中，β-胡萝卜素的生产不仅需要高产量，还需要稳定的生产能力和环境适应性。因此，研究团队对 *D. radiodurans* R1 的代谢系统进行了全面的整合优化，使其能够在不同的环境条件下维持较高的β-胡萝卜素产量。例如，通过引入高效的代谢酶和调控关键基因的表达水平，研究人员成功地构建了一个能够稳定生产β-胡萝卜素的工程菌株。这种菌株不仅能够适应高浓度的未经提纯甘油，还能够在发酵过程中维持较高的细胞密度和产物浓度，从而提高整体的生产效率。

此外，本研究还探讨了未经提纯甘油作为低级碳源在工业生物精炼中的潜力。传统的生物精炼工艺通常依赖于高纯度的碳源，如葡萄糖或甘油，以确保微生物的正常生长和代谢活动。然而，高纯度碳源的获取往往需要复杂的提纯过程，这不仅增加了生产成本，还可能对环境造成额外的负担。相比之下，未经提纯的甘油作为一种低成本、高可用性的碳源，其利用潜力巨大。然而，由于其中的杂质可能对微生物产生毒性，因此需要开发一种能够耐受这些杂质的工程菌株。本研究通过基因工程手段，成功地构建了一种能够在未经提纯甘油中稳定生长并高效生产β-胡萝卜素的菌株，为未来的生物精炼工艺提供了新的思路。

本研究的另一个重要发现是，通过基因改造，*D. radiodurans* R1 的代谢路径可以被重新设计，以提高其对低级碳源的利用效率。传统的代谢工程方法通常依赖于对代谢路径的逐步优化，以提高目标产物的产量。然而，这种方法可能需要大量的实验和调整，耗时较长且成本较高。相比之下，本研究采用了一种基于耐受性的代谢工程策略，即通过增强微生物的抗逆能力，使其能够在含有杂质的环境中维持正常的代谢活动，从而减少对提纯步骤的依赖。这种策略不仅提高了生产效率，还降低了生产成本，为可持续的生物精炼工艺提供了新的技术支持。

β-胡萝卜素的生产不仅具有经济价值，还具有重要的环境意义。作为生物精炼工艺的一部分，β-胡萝卜素的生产能够有效利用工业副产物，减少废弃物的排放，同时降低对化石燃料的依赖。这种循环经济模式符合当前全球对可持续发展的需求，尤其是在碳中和和绿色制造的背景下。通过本研究，研究人员不仅成功地实现了β-胡萝卜素的高效生产，还为未来利用低级碳源进行其他高价值产物的生产提供了借鉴。例如，类似的方法可以用于其他生物活性物质的合成，如类胡萝卜素、生物燃料或生物塑料等，从而进一步拓展生物精炼的应用范围。

本研究的成果表明，*D. radiodurans* R1 作为一种极端微生物，具有开发为高效生物催化剂的巨大潜力。其强大的抗逆能力使其能够在含有杂质的环境中维持正常的代谢功能，而其基因可编辑性则为代谢路径的优化提供了可能性。通过基因工程手段，研究人员成功地将 *D. radiodurans* R1 改造为一种能够高效利用未经提纯甘油的工程菌株，为未来的工业生物精炼工艺提供了新的解决方案。这种工程菌株的开发不仅有助于降低生产成本，还能够减少对环境的影响，推动绿色化学和可持续制造的发展。

总的来说，本研究通过基因工程手段，成功地构建了一种能够高效利用未经提纯甘油生产β-胡萝卜素的工程菌株。这一成果不仅展示了 *D. radiodurans* R1 在生物精炼领域的应用潜力，还为未来利用低级碳源进行高价值产物的生产提供了新的思路。通过减少提纯步骤，提高生产效率，研究人员为实现更加经济和环保的生物精炼工艺奠定了基础。未来，随着更多类似研究的开展，我们有望看到更多基于极端微生物的生物催化剂被开发出来，以应对工业副产物的处理难题，并推动生物技术在可持续发展领域的广泛应用。