四种新型噬菌体的特性研究：这些噬菌体专门针对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），并探讨了它们单独作用及联合使用时的溶菌活性

《Current Research in Microbial Sciences》：Characterisation of four novel bacteriophages targeting carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae and their lytic activity alone and in combination

噬菌体Kilian、Trimon、Jurek和Olmo从意大利托斯卡纳水源分离，基因组分析显示无抗生素耐药或毒力相关基因，适合治疗。透射电镜证实前三个为短尾噬菌体（Siphoviridae），Olmo为长尾噬菌体（Myoviridae）。体外实验表明，四者组合（ cocktail）对ATCC BAA-2146及临床分离株（包括产NDM/VIM/KPC酶株）有协同杀菌作用，可抑制生物膜形成（>4 log10 CFU/mL）。动物模型显示纯化后噬菌体对果蝇幼虫安全。研究为多重耐药K. pneumoniae的噬菌体疗法提供了新资源。

　　研究团队由来自意大利比萨大学生物系的科学家组成，其中包括Elisa Fausti、Andrea Bonacorsi、Novella Cesta、Cesira Giordano、Simona Barnini、Magda Marchetti、Claudia Campobasso、Rob Lavigne、Anna Altieri、Cartesio D’Agostini、Marco Iannetta、Vincenzo Malagnino、Arianna Tavanti、Loredana Sarmati和Mariagrazia Di Luca。这项研究聚焦于一种名为Klebsiella pneumoniae的医院感染病原体，其对多种抗生素产生了日益严重的耐药性，这使得寻找新的治疗策略变得尤为重要。由于传统抗生素治疗的局限性，科学家们对噬菌体疗法的兴趣逐渐上升，将其作为抗生素的补充或替代手段。本研究的目标是分离并表征能够有效攻击多重耐药K. pneumoniae的噬菌体，并评估其治疗效果。

K. pneumoniae是一种机会性病原体，能够引发严重的感染，如肺炎、血液感染和尿路感染。其形成生物膜的能力显著增强了致病性，并使治疗变得更加复杂，因为生物膜可以保护细菌免受宿主免疫系统和抗菌药物的攻击。临床相关K. pneumoniae生物膜通常出现在导管和植入医疗器械的表面。此外，铁载体、菌毛、外排泵和高粘液性等特性也有助于其在体内存活和逃避免疫反应，进一步增加了其临床影响。治疗K. pneumoniae相关感染的一大挑战在于其遗传能力，使其能够发展出抗生素耐药性。这种病原体已经获得了对许多一线抗生素的耐药性，包括β-内酰胺类抗生素和氨基糖苷类抗生素，这限制了有效的治疗选择。特别是产碳青霉烯酶的K. pneumoniae菌株，对碳青霉烯类抗生素表现出抗性，而这类抗生素通常被视为治疗患者的最后手段。关键的碳青霉烯酶包括VIM（Verona integron-encoded metallo-β-lactamase）、KPC（K. pneumoniae carbapenemase）和NDM（New Delhi metallo-β-lactamase）。这些菌株通常与高风险序列类型（STs）相关，如ST258、ST11和ST147，这些菌株在全球范围内流行，与医院内爆发相关，构成了重大的公共卫生挑战。在意大利，ST147的K. pneumoniae菌株与NDM产生相关，近年来已被认为是导致感染爆发的重要因素。例如，在托斯卡纳发生的一次大规模爆发中，涉及1,645例NDM阳性临床分离株，其中90.9%为K. pneumoniae。ST147/NDM-1 K. pneumoniae的基因组分析揭示了复杂的耐药基因组（resistome）和毒力基因组（virulome），这是由于获得了多个可移动的遗传元件，包括编码yersiniabactin的整合性接合元件、携带blaNDM-1的FIB(pQil)型质粒以及同时包含耐药性和毒力基因的嵌合质粒。该克隆对几乎所有抗生素表现出抗性，仅对cefiderocol、aztreonam-avibactam、colistin和fosfomycin有反应。毒力在不同菌株之间存在差异，这在Galleria mellonella和血清杀菌试验中有所体现，而耐药表型则与染色体位点如csrD、pal和ramR的突变有关。

噬菌体，一种专门感染细菌的病毒，已成为对抗多重耐药（MDR）病原体如K. pneumoniae的有前途的策略。噬菌体通过以菌株水平为单位裂解细菌细胞的方式起作用，这种方式可以最小化对微生物群落的非目标影响，并降低系统性副作用的可能性。此外，噬菌体具有自我增殖的能力，能够在感染部位数量增加，从而对细菌施加选择压力，这可能导致进化上的权衡事件，如毒力降低或抗生素敏感性恢复。噬菌体疗法有两种主要方法。第一种方法是个性化噬菌体准备，通常由专门针对从患者体内分离出的细菌菌株的噬菌体组合组成。这种特异性解决了许多噬菌体的狭窄宿主范围问题，确保了对临床分离株的有效性。第二种方法则专注于广谱噬菌体组合的开发，这些组合不仅针对多种细菌菌株，还旨在延迟耐药变异体的出现，使其适用于治疗多个具有类似感染的患者。

体外研究表明，噬菌体组合在对抗K. pneumoniae方面具有显著效果，能够扩大宿主范围并抑制耐药变异体的出现。这些组合在减少生物膜相关感染中也表现出显著的成功。临床前模型进一步支持了这些发现，突出了噬菌体组合在破坏生物膜和提高治疗效果方面的潜力。除了临床前证据外，患者治疗的成果也令人鼓舞。大多数科学文献强调了个性化噬菌体疗法的有效性，这种疗法通常与抗生素联合使用。例如，一位57岁的患者因肠道、尿液和永久性外部侵入装置中K. pneumoniae的持续定植而接受了为期三周的个性化噬菌体疗法（噬菌体vB_KpnM_GF），结果导致病原体完全根除且无复发。另一份病例报告中，一位62岁的糖尿病患者因慢性假体膝关节感染而接受了静脉注射噬菌体疗法（噬菌体KpJH46Φ2），感染在治疗后34周内得到解决，并且临床恢复持续。此外，一项针对各种多重耐药细菌感染的回顾性分析报告称，个性化噬菌体疗法在77.2%的病例中显示出临床改善，并在61.3%的病例中实现了细菌根除。其中，一位30岁的爆炸伤患者因骨折相关的K. pneumoniae感染而接受了预适应的噬菌体治疗（噬菌体vB_KpnM_M1），结合meropenem、colistin和后来的ceftazidime/avibactam，实现了显著的临床和微生物学改善。文献中唯一记录的单独使用噬菌体疗法的案例描述了一位70岁的肾移植女性患者，其因产广谱β-内酰胺酶（ESBL）的K. pneumoniae引起的反复尿路感染接受了为期四周的静脉注射噬菌体疗法，使用了三种裂解噬菌体（Metamorpho、Mineola和pKp20）的组合。治疗成功根除了ESBL菌株，治疗后206天未见复发，随后的K. pneumoniae感染对口服抗生素敏感，不再需要静脉注射抗生素。

这些证据强调了单个噬菌体和噬菌体组合在对抗多重耐药和生物膜相关K. pneumoniae感染中的潜力。发现新的噬菌体并将其战略性地组合成定制的噬菌体组合是实现标准化和个性化噬菌体疗法的关键。这些方法利用噬菌体的高特异性，选择性地针对耐药细菌菌株，同时最小化非目标效应。这种策略不仅增强了治疗效果，还为应对日益严重的抗菌素耐药性威胁提供了应对措施。

在这一背景下，本研究旨在对从意大利托斯卡纳的水样中分离出的四种K. pneumoniae噬菌体进行基因型和表型特征分析。此外，还评估了这些噬菌体单独或作为组合使用时对抗多重耐药K. pneumoniae菌株的抗菌效果，包括游离细胞和生物膜相关细胞。最后，使用Galleria mellonella幼虫作为体内模型评估了噬菌体的安全性。

研究材料包括K. pneumoniae ATCC BAA-2146菌株，该菌株作为噬菌体分离和表型分析的宿主。研究还使用了来自不同意大利医院的89株临床分离株，这些菌株包括产碳青霉烯酶（KPC）、NDM和VIM的菌株，以及ST37、ST147、ST307和ST512等序列类型。其中，34株为NDM产生菌株，33株属于ST147，来自Cisanello医院，另一株来自Policlinic Tor Vergata医院。KPC产生菌株是最大的群体，共46株。具体来说，来自Cisanello医院的四株KPC产生菌株属于ST512，两株属于ST307，三株属于ST37，来自Policlinic San Matteo医院的四株ST307菌株，31株来自Policlinic Tor Vergata医院，一株来自Borsellino医院，另一株来自Santa Maria della Misericordia医院。来自Policlinic Tor Vergata医院的七株VIM产生菌株。此外，还包括两株没有基因型和序列类型信息的菌株，一株来自Policlinic San Matteo医院，另一株来自Policlinic Tor Vergata医院。还使用了14株大肠杆菌菌株，用于验证K. pneumoniae噬菌体的宿主范围。所有细菌菌株均在37°C下培养在LB肉汤和LB琼脂平板中，细菌储存液在-80°C下使用冷冻珠保存系统保存。

噬菌体的分离遵循先前描述的协议，并进行了修改。从托斯卡纳收集的河流或污水样本在4°C下以5000×g的速度离心20分钟，然后过滤（0.22 μm；Euroclone的Primo注射过滤器）。接着，将10 mL上清液与等体积的两倍浓缩LB肉汤补充10 mM CaCl?和10 mM MgSO?混合，并在37°C下与100 μL的K. pneumoniae ATCC BAA-2146过夜培养物孵育，同时在Edmund Buhler GmhH-KS15孵育器中以80 rpm的速度摇动。经过24小时孵育后，富集样本在4°C下以5,000×g的速度离心20分钟。过滤后的上清液被斑点在K. pneumoniae ATCC BAA-2146菌落上，以确定噬菌体的活性。所有噬菌体的滴度通过双层琼脂斑点法测定，使用10倍稀释的噬菌体进行。

噬菌体基因组的提取、测序和生物信息学分析使用了多种方法。为了去除细菌DNA，将180 μL的噬菌体裂解液与20 μL的10× DNaseI缓冲液和10 μL的RNA-free DNaseI（1 U/μL）（Thermo Fisher Scientific）混合，并在37°C下孵育30分钟。接着，加入20 μL的50 mM EDTA和1% SDS以失活DNaseI。然后，加入10 μL的蛋白酶K（>600 U/μL）（Thermo Fisher Scientific）并在55°C下孵育45分钟。DNA随后使用Zymo Research的DNA Clean&Concentrator?试剂盒进行纯化。纯化的DNA使用NanoDrop? Lite分光光度计（Thermo Scientific?，米兰，意大利）进行定量，并在-20°C下储存。对于Illumina测序，使用Nextera Flex DNA Library Kit制备文库。对于每个样本，原始数据提交到BV-BRC在线平台v3.6.12，并使用Unicycler v0.4.8进行噬菌体基因组的组装。BLASTn用于筛选NCBI核苷酸集合数据库，以找到与噬菌体基因组序列相似的序列。任何新物种都根据Turner及其同事（2021）的指南进行确定。最终的FASTA序列被提交到BV-BRC平台进行基因组注释，使用RASTtk，随后进行手动功能注释，通过将BV-BRC预测的编码序列（CDSs）与GenBank非冗余蛋白质数据库（Kelley和Sternberg，2009）进行比较，使用BLASTp。通过ABRicate分析噬菌体基因组中是否存在与毒力和抗生素耐药性相关的基因，使用了Comprehensive Antibiotic Resistance Database（CARD）、ResFinder、NCBI和Virulence Factor Database（VFDB）等数据库。通过ViPTree生成系统发育树，选择相似性基因组（S?）在0.70至1之间的噬菌体基因组。各噬菌体之间的基因组间距离通过VIRIDIC评估。通过比较新分离噬菌体的终止酶序列与具有已知基因组包装系统的噬菌体序列，研究了病毒子代的包装策略。

通过透射电子显微镜（TEM）对K. pneumoniae噬菌体的形态进行分析。每个样本取10 μL，吸收在覆盖有formvar/carbon的400目铜网格上（Agar Scientific，Essex，英国）。通过滤纸去除多余的样本，然后加入10 μL的2%（w/v）磷酸钨酸（pH 7.0），并在30秒内孵育。随后，使用FEI/Philips EM 208S透射电子显微镜（FEI，埃因霍温，荷兰），以100 kV的加速电压进行观察，配备有Megaview SIS相机（Olympus，汉堡，德国）。采集的图像通过Fiji V1.0进行分析。

噬菌体宿主范围和感染效率（EOP）的确定通过斑点试验进行。具体而言，将10 μL的噬菌体裂解液，初始浓度为101? PFU/mL，在10倍稀释后斑点在新鲜制备的细菌菌落上。平板在37°C下孵育过夜。计数斑点，并计算感染效率（EOP）。在某些情况下，虽然没有可计数的斑点，但在高噬菌体浓度下观察到了裂解环。为了评估这些噬菌体对特定细菌菌株的感染和增殖能力，将指数期细菌细胞与噬菌体在MOI为0.1的条件下共培养24小时，温度为37°C，摇速为110 rpm。噬菌体滴度随后通过斑点试验进行测定。

噬菌体吸附试验和一步生长曲线分析用于研究四个噬菌体与宿主细菌K. pneumoniae ATCC BAA-2146的相互作用和复制周期。结果以未吸附噬菌体的百分比随时间变化的形式表达。Kilian、Trimon和Jurek在感染后5分钟达到最大吸附率，分别为92.67%、96.67%和93.31%。相比之下，Olmo在2.5分钟时达到最大吸附率55.75%。一步生长曲线显示，Trimon和Olmo的潜伏期约为15分钟，爆发量分别为约69和22 PFU/CFU。相反，Kilian和Jurek的潜伏期较短，分别为5和10分钟。这两种噬菌体的爆发量较高，Kilian产生约474个病毒颗粒，Jurek产生约196 PFU/CFU。Olmo的完整复制周期约为130分钟，而Kilian、Trimon和Jurek的复制周期分别为100、80和90分钟。

研究了噬菌体对K. pneumoniae菌株的宿主范围和感染效率（EOP）。四个噬菌体在针对89株临床分离株和宿主Kp ATCC BAA-2146的测试中显示出狭窄的宿主范围。Kilian对四株菌株有效，包括cKp1236（ST37，KPC）、tKp9（KPC）、tKp4（VIM）和tKp22（VIM）。Trimon对四株菌株有效，包括cKp1236、tKp4、tKp30和tKp22。Jurek对三株菌株有效，包括cKp1236、tKp30和tKp4。Olmo对四株菌株有效，包括cKp1235（ST512，KPC）、tKp9、tKp41（KPC）和tKp4。对于27株K. pneumoniae菌株，观察到扩散的不透明裂解环，没有单个斑点的出现。这种现象可能是因为在没有有效噬菌体感染的情况下，发生自外裂解。为了确定这些菌株是否发生了噬菌体感染，进行了液体感染试验，在MOI为0.1的条件下与噬菌体共培养24小时，并评估了噬菌体滴度的变化。在测试的六株菌株中，至少有一种噬菌体的斑点数量超过了初始接种滴度，表明这些菌株中发生了噬菌体的增殖。

为了进一步探讨跨属宿主特异性，噬菌体被测试在14株大肠杆菌临床分离株上。没有任何噬菌体-菌株组合显示出裂解活性，这证实了噬菌体的宿主特异性。然而，这种缺乏活性并不能排除大肠杆菌对噬菌体的敏感性或跨属感染的可能性，例如在Enterobacteriales科中（如Enterobacter、Citrobacter、Salmonella、Shigella和Cronobacter）。

本研究将四个噬菌体组合成一个组合，以评估其对选定临床分离株的整体活性，采用精准噬菌体疗法的方法，即根据患者的菌株选择噬菌体。为了进一步研究，研究者认为有必要研究噬菌体受体以及每种噬菌体识别的胶囊类型，从而使其成为有理性的组合的模块化成分，避免冗余，目标是制备广谱噬菌体组合。这些组合可以与额外的噬菌体或胶囊裂解酶结合，不仅扩大宿主范围，还能改善受体的接触并限制耐药性的出现。

在噬菌体疗法中，监测噬菌体的裂解活性对于评估其治疗潜力和检测任何拮抗性相互作用至关重要。本研究展示了每个噬菌体和四个噬菌体组合在宿主菌株K. pneumoniae ATCC BAA-2146和三个临床分离株（tKp4、tKp30和cKp1236）中的裂解动力学。比较个体噬菌体在临床分离株上的体外裂解活性与相应的EOP数据揭示了不同水平的符合度。在cKp1236和tKp4的情况下，有明显的符合度：具有高EOP值的噬菌体也显示出在液体培养中对细菌负荷的强而持久的抑制作用。相比之下，tKp30菌株的符合度较为线性。对于tKp30菌株，尽管大多数噬菌体的EOP值较低或无法检测到，但Trimon和Jurek在高MOI条件下表现出早期阶段的暂时性抑制作用，而噬菌体组合则显示出在早期和晚期阶段均有显著的裂解特征。这些结果表明，单独的EOP试验可能低估某些噬菌体的治疗潜力，特别是在更接近体内条件的动态环境中。同时，也突显了噬菌体组合的价值，它们可以利用个体活性的不足或无法检测到的情况，通过可能的协同作用将其转化为稳健且具有临床意义的抗菌效果。尽管所有噬菌体均使用相同的细菌宿主分离，并且其中三个噬菌体在基因组上较为接近，但它们显示出略微不同的宿主范围和裂解特征。这支持了它们联合使用的原因，表明虽然它们可能针对相同的细菌表面受体，但可能与该受体的不同部分相互作用。这种差异相互作用可能是体外条件下观察到的协同效应的基础。Forti及其同事描述了类似的策略，其中使用了基因组差异小于8%且宿主范围不同的相关噬菌体进行噬菌体组合，支持了增强治疗效果的策略。此外，噬菌体组合在临床环境中的使用可能克服耐药性的发展。

本研究还探讨了噬菌体对生物膜的抗菌活性，无论是单独使用还是作为组合使用。在治疗后三小时，所有噬菌体与未处理对照相比均显示出强效的CFU/mL减少，超过了4个对数单位。然而，Olmo显示出最弱的抗菌活性，这可能与其没有裂解环的斑点形态有关，而其他三种噬菌体则产生了裂解环并表现出更好的生物膜实验效果。然而，在噬菌体暴露24小时后，生物膜中的细菌再生表明了耐药性变异体的出现，正如在研究中为防止K. pneumoniae生物膜中耐药性变异体的发展而进行的实验所报道的那样。如多项研究所示，噬菌体与抗生素的组合使用可能为治疗生物膜相关感染提供有前景的治疗方案。这些发现对于管理假体相关感染和长期导管使用相关感染尤为重要，因为生物膜的形成构成了重大的临床挑战。

动物实验的数据对于评估噬菌体疗法的安全性至关重要，G. mellonella作为一种敏感且有效的初步指标，为体外实验和哺乳动物模型之间架起了一座桥梁。在本研究中，G. mellonella提供了毒理监测的早期数据，表明为了推进到体内有效性测试，噬菌体准备应充分纯化以减少内毒素和其他细菌污染物。为此，我们通过CsCl梯度超速离心获得了高滴度的噬菌体储备，这表明这些储备可能污染较少，如未处理裂解液所示，离心后的噬菌体在体内存活时间较长。在先前的G. mellonella研究中，噬菌体准备通常采用两种纯化方法：PEG沉淀后CsCl梯度超速离心（Thiry等，2019）或仅采用CsCl梯度超速离心（Han等，2023），且幼虫在两种情况下均存活。然而，在使用未纯化的裂解液的情况下，K. pneumoniae噬菌体?BO1E并未影响幼虫的存活，这可能是因为准备中的细菌污染物较少，可能反映了所使用的K. pneumoniae菌株内毒素含量较低或毒力较低。在我们的研究中，由于裂解液导致幼虫在24小时内死亡，因此需要进一步纯化。CsCl梯度超速离心被选为去除内毒素的高效方法。最后，尽管G. mellonella是一种敏感且有效的初步指标，但它并不能重现哺乳动物的药代动力学（PK）和药效动力学（PD）或适应性免疫反应（Ménard等，2021）。因此，安全数据应触发在符合定量释放标准的鼠感染模型中的确认研究（例如，接受的内毒素水平在EU/mL内和最小的残留宿主DNA/蛋白质携带）。

综上所述，我们对所呈现的噬菌体的全面基因型和表型特征分析，结合其在对抗碳青霉烯耐药K. pneumoniae菌株方面的体外活性，为它们在临床环境中的潜在治疗应用奠定了坚实的基础。然而，进一步的体内模型实验可能有助于在更复杂的生物环境中确定PK和PD参数。