基于超基因分型测序技术对八个山羊品种的人口结构进行分析

《Gene》：Population structure analysis of eight goat breeds based on super-genotyping-by-sequencing

中国本土山羊遗传多样性及适应机制研究。采用Super-GBS测序技术分析8个山羊种群（211个体），揭示Ziwuling黑山羊（ZWL）遗传多样性最高，Dazu黑山羊（DZH）最低，地理隔离导致DZH与辽宁/内蒙古山羊（NMC）显著分化（FST=0.1221），而ZWL黑山羊（ZWLH）与河西走廊山羊（HXC）存在基因交流（FST=0.0066）。发现252个与产毛相关的候选基因（如DCN、SEMA3D、FGF5），及372个适应干旱（如MTOR、ROBO2、PPP3CA）和亚热带环境的关键基因，揭示人工选择与环境影响共同塑造山羊基因组架构，提出优先保护多样性下降种群（如ZWLH、SXC）及控制近亲繁殖的保育策略。

　　中国拥有丰富的本地山羊资源，这些资源在农业和生态系统中具有重要的价值。然而，随着外来品种的引入和杂交现象的增加，本地山羊种群的数量正在下降，其遗传结构也变得模糊。为了更好地保护和利用这些珍贵的基因资源，有必要对关键的本地山羊种群进行遗传多样性与种群结构的评估。本研究采用了一种先进的基因组测序技术——Super-GBS，对来自不同地理区域的八个山羊品种（共计211只）进行了遗传多样性与种群结构分析，并通过选择信号分析识别出与生产性状和环境适应能力相关的候选基因。研究结果显示，紫云岭黑山羊（ZWL）表现出最高的遗传多样性，而大足黑山羊（DZH）则显示出最低的多样性。通过成对的FST值分析，发现DZH与辽宁绒山羊/内蒙古绒山羊（NMC）之间存在显著的分化（FST值为0.1221），这可能是由于地理隔离所致；而紫云岭绒山羊（ZWLH）与河西绒山羊（HXC）之间的分化则非常微弱（FST值为0.0066），表明存在基因流动。种群结构分析进一步揭示了三个主要的遗传分支：DZH作为独立的遗传线，沂蒙黑山羊（YMH）则与ZWL形成一个聚类，而多个绒山羊亚群则显示出不同的遗传特征。此外，通过全基因组同源性（ROH）分析，发现DZH的近亲繁殖程度较高（FROH值为0.178），而绒山羊品种的近亲繁殖程度则相对较低（0.071–0.098）。选择信号分析还识别出252个与绒毛性状相关的基因，包括DCN、SEMA3D、FGF5等，这些基因富集在调控毛囊周期的TGF-β、MAPK和昼夜节律通路中。进一步比较干旱适应型NMC与亚热带适应型DZH，发现了372个与产热、水分重吸收和缺氧响应相关的基因，例如MTOR、ROBO2、PPP3CA等。这些结果表明，人工选择和环境适应共同塑造了山羊的基因组结构。因此，保护工作应优先关注遗传多样性下降的种群，如ZWLH和SXC，并采取控制性繁殖措施以减少近亲繁殖，从而保障农业生物多样性与可持续利用。

山羊作为重要的农业动物，其遗传资源的多样性不仅关系到种群的健康与生存能力，也直接影响到畜牧业的生产力和适应性。中国幅员辽阔，生态环境多样，使得山羊在长期的自然选择和人工育种过程中形成了独特的遗传特征。这些特征包括对饲料的强适应能力、优越的繁殖性能以及对环境的高抗逆性。目前，中国保存了87个本地山羊品种，总数超过2740万只，是全球山羊遗传资源最丰富的国家之一。然而，近几十年来，由于与引进的商业品种进行非选择性的杂交，导致本地山羊品种的遗传多样性迅速流失。此外，技术限制、保护管理不足以及资金短缺等多重因素也加剧了这一危机。这一现象不仅威胁到许多本地山羊品种的生存，还可能造成宝贵遗传特征和传统农业文化的不可逆损失，对全球生物多样性构成重大风险。因此，对中国的本地山羊品种进行系统的遗传多样性与种群结构评估，对于制定有效的保护策略具有重要意义。

在基因组研究领域，测序技术经历了从第一代Sanger测序到第二代高通量测序（NGS）以及第三代单分子测序技术的演变。NGS平台基于Sanger测序原理，因其高通量性和成本效益而成为主流技术。它主要包括两种策略：全基因组重测序和简化基因组测序（RRGS）。RRGS方法通过限制性内切酶对基因组DNA进行靶向切割，随后对特定的限制性片段进行高通量测序，从而获取全基因组的多态性标记。与全基因组重测序相比，RRGS方法具有简化的工作流程、成本效益以及无需参考基因组的优势（因为不同样本中相同限制性位点两侧的区域可以自然对齐，从而允许直接比较这些同源区域内的SNP和其他变异）。因此，RRGS特别适用于种群遗传进化、人口历史重建和遗传图谱研究。当前主流的RRGS方法包括RAD-seq（限制性位点关联DNA测序）、GBS（基于测序的基因分型）以及SLAF-seq（特定位点扩增片段测序）。这些技术在实际应用中展现了其独特的价值。例如，SLAF-seq方法在对陇南山羊种群的研究中揭示了遗传分化现象，并检测到了来自博尔山羊的基因流动，为制定保护优先策略提供了分子依据。同样，使用GBS-seq方法的一项研究发现，云上黑山羊种群的近亲繁殖系数相对较高，进一步凸显了遗传多样性下降的风险。

本研究旨在采用Super-GBS测序技术——一种先进的GBS方法，能够提供更高的SNP可重复性、更稳定的基因分型和更高的准确性——对来自不同地理区域的八个山羊种群进行分析。通过生成高密度的SNP数据集，研究目标包括：（1）评估当前的遗传多样性水平；（2）阐明种群间的遗传结构和系统发育关系；（3）识别与经济性状相关的候选基因。这些研究结果将为制定针对性的保护策略提供分子基础，以更好地保护本地山羊的遗传资源。

在样本采集和测序过程中，研究团队共收集了211份血液样本，这些样本来自八个不同的山羊种群（ZWLH、ZWLN、YMH、DZH、LNC、HXC、SXC、NMC），并涵盖了多样化的地理区域（图1、表S1）。样本通过颈静脉采血获得，并在?80?°C的低温条件下保存，以便后续提取基因组DNA。基因分型测序库的构建过程遵循标准操作流程，所有DNA浓度均通过Qubit? 2.0荧光计（使用dsDNA HS检测试剂盒）进行量化，只有那些浓度超过5.0?ng/μL的库被选中用于测序。测序过程中，每个库的DNA浓度为30?ng，以确保测序的准确性和一致性。

在基因型质量控制方面，研究团队共产生了175,619,606条原始测序数据。经过质量过滤后，保留了154,180,692条清洁数据，其平均GC含量为51.37%，Q30得分为89.57%。这些清洁数据中，有99.88%成功比对到参考基因组，最终获得了390,835条高质量的SNP用于后续分析。质量控制过程确保了数据的准确性和可靠性，为遗传多样性评估和种群结构分析提供了坚实的基础。

在遗传多样性评估方面，研究团队发现所有种群的Hardy-Weinberg平衡（HWE）p值均大于0.05，表明种群处于遗传平衡状态。在所有群体中，观察到的杂合度（Ho）均低于期望杂合度（He），而有效等位基因数（Na）均高于有效个体数（Ne），这反映了种群中存在一定程度的遗传多样性。紫云岭绒山羊（ZWLH）和紫云岭黑山羊（ZWL）表现出较高的遗传多样性，而大足黑山羊（DZH）和一些绒山羊种群则显示出较低的遗传多样性。这一结果表明，不同地理区域的山羊种群在遗传多样性方面存在显著差异，可能与它们的生存环境、人工选择强度以及繁殖策略有关。

通过进一步的种群结构分析，研究团队发现八个山羊种群可以分为三个主要的遗传分支：DZH作为独立的遗传线，YMH则与ZWL形成一个聚类，而多个绒山羊亚群则显示出不同的遗传特征。这种遗传结构的差异可能与种群间的地理隔离、基因流动以及人工选择的历史有关。例如，DZH与NMC之间的显著分化（FST值为0.1221）可能与它们所处的地理环境差异和长期的种群隔离有关，而ZWLH与HXC之间的微弱分化（FST值为0.0066）则表明存在基因流动，这可能是由于它们之间的亲缘关系较近或存在长期的杂交历史。

此外，研究团队还通过全基因组同源性（ROH）分析，发现DZH的近亲繁殖程度较高（FROH值为0.178），而绒山羊品种的近亲繁殖程度则相对较低（0.071–0.098）。这一结果表明，DZH可能经历了更严重的近亲繁殖，而绒山羊品种则保持了相对较高的遗传多样性。这种差异可能与种群的繁殖策略、种群规模以及保护措施的有效性有关。

选择信号分析则揭示了与绒毛性状相关的候选基因，包括DCN、SEMA3D、FGF5等，这些基因富集在TGF-β、MAPK和昼夜节律通路中，这些通路在调控毛囊周期方面发挥重要作用。此外，比较干旱适应型NMC与亚热带适应型DZH，研究团队还发现了372个与产热、水分重吸收和缺氧响应相关的基因，例如MTOR、ROBO2、PPP3CA等。这些基因的发现不仅有助于理解山羊在不同环境下的适应机制，也为进一步研究山羊的遗传适应性提供了新的视角。

总体而言，本研究揭示了中国本地山羊种群的遗传多样性与适应性分化。研究结果表明，地理隔离和基因流动在塑造遗传分化方面发挥了关键作用，而人工选择则对山羊的基因组结构产生了深远影响。因此，保护工作应优先关注遗传多样性下降的种群，并采取控制性繁殖措施以减少近亲繁殖，从而保障农业生物多样性与可持续利用。同时，这些研究结果也为进一步的基因组研究、种群遗传分析以及基因功能研究提供了重要的基础，有助于推动山羊遗传资源的保护与利用。