突破PAM限制：一种基于粘性末端介导的CRISPR/Cas12a与RPA耦合的通用双链DNA检测方法及其在KRAS G12C单碱基突变检测中的应用

《Analytical Chemistry》：Breaking the PAM Restriction: A Universal Double Stranded DNA Detection Method Based on the Sticky End-Mediated CRISPR/Cas12a Coupled RPA and Its Application to KRAS G12C Single Base Mutations

本研究开发了一种通用PAM-free的CRISPR/Cas12a检测平台，通过整合粘性末端介导的CRISPR/Cas12a与重组酶扩增（RPA），利用NlaIII酶切实现扩增产物精准切割，形成标准粘性末端，显著提升Cas12a活性。该方法灵敏度达40 aM，成功检测0.1%频发的KRAS G12C突变，与FastNGS结果一致，并实现单管检测策略，简化流程并降低气溶胶污染。

　　

CRISPR/Cas12a系统能够高效且特异性地检测核酸，但其对Protospacer Adjacent Motif（PAM）序列的依赖性以及现有基于粘性末端的检测方法的复杂性，给稳定和便携的应用带来了挑战。为了解决这些问题，本研究通过将粘性末端介导的CRISPR/Cas12a与重组酶聚合酶扩增（RPA）结合，开发了一种通用的双链DNA（dsDNA）检测方法。通过在RPA引物中引入NlaIII识别位点，实现了扩增产物的精确切割，生成了均匀的粘性末端，并消除了对PAM位点的依赖。与含有PAM位点的平末端dsDNA相比，使用粘性末端dsDNA显著增强了Cas12a的活性。该策略表现出良好的灵敏度和特异性，检测限达到40阿摩尔（aM），并能以0.1%的频率成功识别KRAS G12C突变，其基因组DNA检测结果与FastNGS的结果一致。此外，我们还初步探索了一种单管检测方法，有效简化了操作流程并减少了气溶胶污染。总之，我们建立了一种简单、灵敏且通用的无PAM依赖性的CRISPR/Cas12a检测平台，该平台结合了等温扩增和标准化粘性末端设计的优势，为分子诊断和临床应用提供了广泛的应用前景。