NnWOX1-1调控NnDREB2C通过乙烯途径促进莲藕不定根形成的分子机制

《BMC Plant Biology》：NnDREB2 regulated by NnWOX1-1 is involved in adventitious root formation in lotus root (Nelumbo nucifera Gaertn.)

本研究针对莲藕不定根形成机制不清的问题，开展了NnWOX1-1调控下游靶基因NnDREB2C影响不定根形成的功能解析。研究人员通过酵母单杂交和EMSA实验证实NnWOX1-1直接结合NnDREB2C启动子，利用转基因技术证明过表达NnWOX1-1和NnDREB2C均可显著促进莲藕和慈姑不定根数量和长度，并发现二者通过调控乙烯合成途径影响根器官发生。该研究首次揭示了WOX-DREB分子模块在莲藕不定根形成中的调控作用，为水生蔬菜根系改良提供了新靶点。

　　

莲藕作为我国重要的水生经济作物，其独特的地下茎膨大特性使其成为食品加工和药用领域的重要原料。然而在生产实践中，莲藕的不定根发育状况直接影响养分吸收效率和产品器官形成，成为制约产量提升的关键因素。与大多数植物不同，莲藕的主根早期退化，其生长发育完全依赖不定根系统，这使得解析不定根形成的分子机制具有重要的理论和实践意义。

在植物发育生物学领域，不定根形成受到复杂调控网络的精确控制。前人研究表明，WOX（WUSCHEL-related homeobox）转录因子家族在植物器官发生和干细胞维持中发挥核心作用，而AP2/ERF超家族中的DREB（dehydration-responsive element binding）亚家族则参与多种逆境响应和发育过程。扬州大学研究团队前期发现NnWOX1-1在拟南芥中过表达能促进根系发育，但该基因在莲藕中的具体功能及其调控网络仍待阐明。

为了深入揭示莲藕不定根形成的分子机制，研究人员在《BMC Plant Biology》上发表了最新研究成果。研究团队综合运用分子生物学、遗传学和生物化学方法，通过亚细胞定位、转基因技术、酵母单杂交、电泳迁移率实验（EMSA）和激素测定等技术手段，系统解析了NnWOX1-1及其下游靶基因NnDREB2C在莲藕不定根形成中的调控作用。

关键技术方法概述

研究以太空莲36号组培苗为材料，通过农杆菌介导的瞬时转化在莲藕和慈姑中实现基因功能验证。利用烟草叶片表皮细胞系统进行蛋白亚细胞定位分析，通过酵母单杂交技术筛选NnWOX1-1互作靶点，采用EMSA验证转录因子与DNA的直接结合作用。构建过表达和RNA干扰载体转化模式植物，通过qRT-PCR鉴定阳性转基因植株，使用气相色谱和液相色谱技术测定乙烯和生长素含量。

NnWOX1-1的亚细胞定位与功能分析

研究人员首先通过烟草叶片瞬时表达系统发现NnWOX1-1-GFP融合蛋白同时定位于细胞核和细胞膜

。在莲藕和慈姑中的功能验证表明，过表达NnWOX1-1能显著增加不定根数量和长度，而RNA干扰株系则出现根系发育抑制现象。激素含量测定显示过表达株系乙烯和生长素（IAA）水平显著升高，干扰株系乙烯含量下降但生长素无显著变化，提示NnWOX1-1主要通过调控乙烯合成影响不定根形成。

下游靶基因的筛选与验证

通过酵母单杂交技术从 motif 库中筛选到29个与NnWOX1-1互作的候选序列

，其中一段 motif 位于NnDREB2C启动子区。EMSA实验证实NnWOX1-1能直接结合NnDREB2C启动子序列，且NnWOX1-1过表达株系中NnDREB2C转录水平上调，干扰株系中表达下降，证明NnDREB2C是NnWOX1-1的直接下游靶标。

NnDREB2C的克隆与表达特性

成功获得NnDREB2C的615 bp完整开放阅读框，编码205个氨基酸的蛋白，含有典型AP2结构域

。表达分析显示NnDREB2C受乙烯利和蔗糖诱导表达，峰值出现在处理18小时，而对IAA处理不敏感。组织特异性表达显示其在叶片中表达最高，其次为叶柄、花和节间，种子中表达最低。

NnDREB2C的亚细胞定位与功能

亚细胞定位显示NnDREB2C为核定位蛋白

。功能验证表明过表达NnDREB2C显著促进莲藕和慈姑不定根形成，增加植株鲜重和干重，而干扰株系根系发育受阻。激素测定显示过表达株系乙烯和生长素含量升高，干扰株系乙烯含量下降但生长素无显著变化。

乙烯补偿实验

用300 mg/L乙烯利处理基因沉默植株后

，NnWOX1-1和NnDREB2C干扰株系的不定根数量和长度与对照无显著差异，说明外源乙烯能补偿基因沉默造成的根系缺陷，证实乙烯在该调控通路中的关键作用。

研究结论与意义

本研究首次在莲藕中揭示了NnWOX1-1-NnDREB2C分子模块通过调控乙烯合成影响不定根形成的完整通路。NnWOX1-1通过直接结合NnDREB2C启动子调控其转录，进而影响乙烯生物合成，最终促进不定根形成。该发现不仅深化了对WOX和DREB转录因子家族功能的认识，还为通过基因工程手段改良水生蔬菜根系构型提供了理论依据。研究建立的莲藕遗传转化体系为其他水生作物基因功能研究提供了技术参考，相关基因在慈姑中的保守功能提示该调控通路可能在水生植物中具有普适性价值。