阿尔茨海默病PSEN-2 N141I突变揭示人iPSC衍生模型中脑内皮细胞表型改变及剪切力敏感性

《Acta Neuropathologica Communications》：Alzheimer’s disease PSEN-2 N141I mutation reveals altered and shear-sensitive brain endothelial cell-like phenotype in human iPSC-derived models

本研究针对阿尔茨海默病(AD)药物研发中缺乏可模拟脑血管药物相互作用的模型这一瓶颈，利用微流控平台构建了患者来源脑内皮样细胞(BECs)的AD脑血管模型。研究人员发现，在静态条件下，AD2-BECs表现出P-gp/BCRP/MRP1外排转运功能受损和单核细胞粘附增加；而施加12 dynes/cm2剪切应力后，这些功能障碍得到改善。该研究首次在体外证实了剪切力缺失会加剧家族性AD(fAD)中脑内皮功能障碍，为理解AD血管病理机制提供了新视角。

　　

在阿尔茨海默病(AD)研究领域，一个长期存在的困境是：尽管在动物模型中取得突破的候选药物层出不穷，但它们最终在人类临床试验中折戟沉沙。这种"转化鸿沟"的背后，是传统研究模型难以真实模拟药物在人体脑血管系统中的复杂相互作用。特别是大脑最重要的保护屏障——血脑屏障(BBB)，其功能受到血液流动产生的剪切应力(shear stress)的精密调控，而这一关键力学因素在常规静态培养模型中完全缺失。

近年来，脑血管系统在AD发病机制中的作用日益受到重视，"AD血管假说"逐渐崭露头角。该假说认为，随着年龄增长、生活方式因素及相关并发症（如低灌注、高血压和糖尿病）导致的初始脑血管损伤，可能是驱动疾病发生的关键因素。更引人注目的是，血管损伤的生物标志物出现时间甚至早于传统的AD生物标志物（如淀粉样蛋白沉积、tau蛋白磷酸化等）。这一发现促使研究人员思考：缺乏血流剪切力的静态培养条件，是否恰好模拟了AD患者中常见的脑低灌注状态？而这种状态是否会进一步加剧AD相关的脑血管功能障碍？

为了回答这一科学问题，多伦多大学的研究团队在《Acta Neuropathologica Communications》上发表了创新性研究。他们利用微流控技术，首次在动态力学环境下系统评估了携带PSEN-2 N141I突变的家族性AD患者来源诱导多能干细胞(iPSC)分化的脑内皮样细胞(BECs)功能表型。

研究人员采用微流控平台(VitroFlo)对细胞施加12 dynes/cm2的生理水平剪切应力，模拟体内毛细血管的血流环境。通过多组学方法，他们比较了静态与剪切条件下AD患者来源细胞(AD2-BECs)与正常对照细胞(fControl-BECs)在屏障通透性、免疫细胞粘附、药物转运功能等多个维度的差异。

关键技术方法包括：1）从携带PSEN-2 N141I突变的AD患者iPSC分化为BECs；2）微流控剪切应力系统模拟生理血流；3）跨内皮电阻(TEER)和荧光示踪剂评估屏障完整性；4）单核细胞粘附实验检测免疫炎症反应；5）外排转运功能评估（P-gp、BCRP、MRP1）；6）Aβ₄₂寡聚体制备与细胞毒性检测。

屏障特性表征

研究团队首先验证了分化获得的BECs具有典型的脑内皮细胞特征，GLUT1和PECAM-1标志物表达阳性率高达76%以上。在屏障功能方面，AD2-BECs与fControl-BECs表现出相似的跨内皮电阻值和4 kDa FITC-葡聚糖通透性，且两种细胞在紧密连接蛋白（claudin-5、occludin、ZO-1）和VE-钙黏蛋白的表达分布上无显著差异。有趣的是，与H9胚胎干细胞来源的BECs不同，iPSC来源的BECs屏障通透性对剪切应力条件不敏感，提示其具有独特的力学响应特性。

单核细胞粘附评估

在免疫炎症反应方面，研究发现了显著差异。静态条件下，AD2-BECs表现出2.2倍的单核细胞粘附增加(p<0.0001)，这一现象与ICAM-1（细胞间粘附分子-1）表达上调密切相关。当使用抗ICAM-1抗体阻断后，单核细胞粘附显著减少，证实了ICAM-1的关键作用。然而，在剪切应力条件下，两种细胞的单核细胞粘附均显著降低，且AD2-BECs与对照组无显著差异，表明生理水平的血流剪切力能够抑制炎症性粘附分子的表达。

BEC转运功能评估

药物转运功能的研究结果尤为引人注目。通过转运蛋白抑制实验，研究人员发现AD2-BECs的三种主要外排转运蛋白功能均显著受损：P-糖蛋白(P-gp)功能降低(p=0.0017)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)功能降低(p=0.0002)、多药耐药相关蛋白1(MRP1)功能降低(p=0.0004)。Western blot分析进一步显示P-gp和BCRP蛋白表达水平下降。然而，在剪切应力条件下，这些功能缺陷得到明显改善，AD2-BECs与对照组无显著差异。在LDL受体介导的内吞功能方面，两组细胞未见差异。

BECs对淀粉样蛋白寡聚体的毒性反应

在淀粉样蛋白毒性方面，研究团队发现AD2-BECs对Aβ₄₂寡聚体更为敏感。MTT实验显示，在不同浓度Aβ₄₂寡聚体处理下，AD2-BECs的细胞活力均低于对照组。当浓度为20μM时，两种细胞均出现乳酸脱氢酶(LDH)释放增加和活性氧(ROS)生成增多，但AD2-BECs的代谢活性下降更为明显。值得注意的是，ELISA检测显示两组细胞的Aβ寡聚体摄取量无差异，表明毒性敏感性的差异并非由摄取能力不同引起。

研究结论与意义

这项研究的核心发现是：剪切应力缺失会加剧PSEN-2 N141I突变相关的脑内皮细胞功能障碍。在静态条件下，AD2-BECs表现出外排转运功能受损、单核细胞粘附增加等AD相关表型；而施加生理水平的剪切应力后，这些异常表型得到显著改善。

这一发现具有多重重要意义：首先，它为"AD血管假说"提供了实验支持，证实脑低灌注（剪切力缺失）可能通过损害血脑屏障功能而促进AD病理进程。其次，研究揭示了剪切应力在维持脑内皮细胞正常功能中的保护作用，提示改善脑血流动力学可能是AD防治的潜在策略。第三，该研究建立了首个整合患者特异性iPSC与微流控力学环境的AD血脑屏障模型，为AD药物筛选提供了更贴近生理条件的平台。

从转化医学视角看，这项研究提示未来AD治疗策略可能需要双管齐下：既针对淀粉样蛋白等经典病理靶点，也关注脑血管功能的保护和恢复。特别是在药物研发早期，采用能够模拟血流动力学的体外模型，可能更准确地预测药物在体内的转运效率和治疗效果。

研究的局限性包括iPSC分化的BECs仍具有一定上皮细胞特征，以及目前仅关注了PSEN-2 N141I这一特定突变。未来研究需要进一步优化分化方案获得更纯的脑内皮细胞，并拓展到其他AD相关基因突变的研究中。

总之，Takeuchi等学者的工作突破了传统静态模型的局限，将力学生物学概念引入AD研究领域，为我们理解血管功能障碍在神经退行性疾病中的作用机制开辟了新途径，也为开发更有效的AD治疗策略提供了重要实验依据。