牙齿老化为普通海豚（Delphinus delphis）的首个表观遗传时钟提供了新的见解

《Ecology and Evolution》：Dental Ageing Offers New Insights Into the First Epigenetic Clock for Common Dolphins (Delphinus delphis)

本研究开发了首个常见海豚（Delphinus delphis）物种特异性表观遗传时钟，利用皮肤样本的DNA甲基化数据，通过弹性网络回归模型评估了包含不同年龄估计样本的三个子集（放松、严格、受限）的性能。结果显示，受限模型表现最佳（MAE=1.80年，r=0.91），但所有模型在预测老年个体时存在低估。分解条件和存储时间对预测误差无显著影响。该时钟为野生动物管理提供了重要工具，有助于应对人类活动对海豚种群的影响。

　　本研究提出了一种针对普通海豚（Delphinus delphis）的首个物种特异性表观遗传时钟，这一工具为深入了解该物种的种群动态、生存状态和繁殖行为提供了新的可能性。普通海豚作为广泛分布于全球海洋的物种，其年龄估算对于种群可持续性分析、种群生存力评估以及种群管理至关重要。然而，传统的年龄估算方法在野生动物研究中面临诸多挑战，尤其是对于这种具有较难识别年龄特征的齿鲸类动物而言。因此，本研究尝试利用表观遗传学方法，特别是DNA甲基化模式，开发一种新的年龄预测模型，以提高年龄估算的准确性和适用性。

### 传统年龄估算方法的局限性

普通海豚的年龄估算通常依赖于牙齿中的生长层组（growth layer groups, GLGs）分析，这一方法被称为“牙齿年龄法”。然而，这种方法在实际操作中存在一定的局限性。首先，生长层组的识别需要经验丰富的专家进行，且在个体年龄较大时，由于牙齿磨损、生长层组压缩以及辅助生长线的干扰，其准确性显著下降。其次，牙齿提取是一种侵入性操作，通常只能在死后进行，限制了其在自由活动种群中的应用。此外，由于牙齿年龄法难以提供精确的年龄数据，尤其是在个体年龄超过16岁后，其误差率较高，这可能影响表观遗传时钟的性能。

为了克服这些限制，研究者们正在探索非侵入性或微创的方法，如利用皮肤或血液样本进行DNA甲基化分析。DNA甲基化是一种表观遗传标记，它在个体生命过程中会随时间发生改变。通过分析这些变化，科学家可以建立表观遗传时钟，以预测生物体的年龄。然而，目前大多数表观遗传时钟的建立都依赖于已知年龄的个体，这些个体通常来自人类管理的环境或长期观察研究，而很少使用自然死亡或意外捕获的野生动物样本。因此，本研究首次尝试使用来自意外死亡或捕获个体的牙齿年龄数据，构建普通海豚的表观遗传时钟，并评估其在不同年龄群体中的表现。

### 研究方法与样本选择

为了确保模型的可靠性，研究团队使用了30年积累的普通海豚组织样本，其中包含了从0到34岁的个体。这些样本来自多种死亡情境，包括单个死亡事件、群体死亡事件以及人类管理环境中的个体。研究者还通过多种指标对样本的年龄进行了交叉验证，如身体长度、卵巢白体（corpora albicans）数量以及胸部X光的骨骼年龄。这些指标有助于提高年龄估算的准确性。

DNA提取过程采用了标准的快速DNA小规模提取方法，确保样本的纯度和完整性。研究团队还使用了高通量DNA甲基化芯片（HorvathMammalMethylChip40）来测量DNA甲基化模式，该芯片覆盖了37,492个CpG位点，能够提供全面的表观遗传信息。为了提高模型的稳健性，研究者对数据进行了严格的质量控制，排除了那些存在显著错误或不一致的样本。

研究团队将样本分为三个子集：宽松子集（relaxed subset）、严格子集（strict subset）和受限子集（restricted subset）。宽松子集包括所有样本，即使某些样本的年龄估计存在不确定性；严格子集则排除了仅能获得年龄范围或最小年龄估计的样本；受限子集则进一步排除了那些预测误差超过6年的样本。这种分层方法有助于评估不同子集对模型性能的影响。

为了构建表观遗传时钟，研究团队采用了弹性网络回归（elastic net regression）和交叉验证（cross-validation）相结合的方法。弹性网络回归是一种适用于高维数据的机器学习算法，能够有效处理多个相关变量之间的关系。通过留一法交叉验证（Leave-One-Out Cross-Validation, LOOCV），研究团队验证了模型的稳定性，并优化了参数选择，以确保最佳的预测效果。

此外，研究还引入了一种混合模型（hybrid epigenetic clock），该模型结合了随机森林分类器（random forest classifier, RFC）和两种弹性网络回归模型。这一方法旨在通过调整甲基化模式的变化，提高对老年个体的年龄预测准确性。随机森林分类器用于判断个体是否已达到生理成熟状态，而弹性网络回归模型则用于预测年龄。这种混合方法在其他物种中已被证明有效，但在普通海豚中仍需进一步优化。

### 研究结果与模型表现

在三个子集中，弹性网络回归模型的表现各有差异。宽松子集的模型表现出一定的误差，其平均绝对误差（mean absolute error, MAE）为2.02年，相关系数（Pearson correlation coefficient, r）为0.81，决定系数（R2）为0.66。严格子集的模型则表现出更高的相关性，但误差率略高于宽松子集，其MAE为2.29年，r值为0.81，R2为0.66。受限子集的模型则显示出最佳的性能，其MAE为1.80年，r值为0.91，R2为0.82。这表明，在排除了高误差样本后，模型的准确性得到了显著提升。

尽管受限子集表现出较高的准确性，但所有模型都显示出对老年个体的低估倾向。这可能是由于牙齿年龄法在老年个体中的误差累积，或者由于表观遗传时钟本身在老年阶段的预测偏差。此外，研究团队还发现，样本的分解状态和储存时间对模型的预测误差没有显著影响，这表明表观遗传时钟的性能在不同条件下保持稳定。

### 表观遗传时钟的可靠性与应用前景

研究团队还比较了普通海豚表观遗传时钟与其他齿鲸类表观遗传时钟的性能。结果显示，普通海豚的表观遗传时钟在不同子集中的表现优于一些多物种时钟，但略逊于某些基于已知年龄个体的物种特异性时钟。这表明，虽然表观遗传时钟在某些方面具有优势，但其性能仍受训练数据质量的影响。

在性别预测方面，研究团队利用弹性网络回归模型对样本进行了性别分类，该模型在所有样本中均表现出100%的准确率。这一结果与其他研究一致，表明DNA甲基化模式在性别预测方面具有较高的可靠性。

### 研究意义与未来方向

本研究的成果对于野生动物保护和种群管理具有重要意义。普通海豚面临多种人为威胁，如渔业捕捞、栖息地破坏和污染，准确的年龄估算有助于评估这些威胁对种群的影响。此外，表观遗传时钟的开发使得科学家能够在不依赖侵入性方法的情况下，对活体动物进行年龄和性别预测，这为长期种群监测和生态研究提供了新的工具。

未来的研究可以进一步优化表观遗传时钟的性能，特别是在老年个体的预测准确性方面。此外，研究者还可以探索其他非侵入性样本类型，如血液或粪便，以扩大表观遗传年龄估算的应用范围。同时，通过增加老年个体的样本数量，可以减少训练数据的年龄分布偏差，从而提高模型的整体性能。

本研究不仅为普通海豚的年龄估算提供了新的方法，也为其他濒危物种的保护研究提供了参考。随着表观遗传学技术的不断发展，这种非侵入性方法有望成为野生动物年龄研究的重要工具，帮助科学家更好地理解物种的生命周期和生态特征。