基于物种特异性eDNA的qPCR检测方法的开发与应用：用于早期识别入侵性海鞘Ascidiella aspersa

《Ecology and Evolution》：Development and Application of a Species–Specific eDNA–Based qPCR Assay for Early Detection of the Invasive Ascidian Ascidiella aspersa

韩国海岸带入侵物种 личиella aspersa的定量PCR检测方法及地理扩展研究。开发了特异性靶向线粒体COI基因的qPCR方法，验证其高灵敏度（LOD=12 copies/reaction）和特异性，在18个港口2019-2021年采集的324份eDNA样本中发现济州岛和东部港口新分布，夏季检测率最高（72%），证实eDNA技术可有效监测海洋入侵物种。

　　近年来，海洋生态系统正面临日益严峻的挑战，包括气候变化、栖息地退化以及外来物种（NIS）的扩散。这些因素不仅导致了生物多样性的丧失，还改变了生态系统的功能，甚至造成了经济损失。在众多海洋生物中，海鞘（ascidians）作为底栖无脊椎动物，常成为附着生物群落中的优势种，并在生态演替过程中发挥重要作用。然而，某些海鞘种类通过人为传播途径，如航运和水产养殖，已经扩散到远离其原生区域的地方，对当地生态系统造成了显著影响。

其中，独居海鞘 *Ascidiella aspersa* 作为一种高度成功的入侵物种，因其强大的繁殖能力和对多种环境条件的适应性而受到广泛关注。该物种在全球范围内广泛分布，尤其是在温带沿海地区，常通过竞争本地物种和改变附着生物群落的组成，对生态系统的结构和功能产生深远影响。这些现象凸显了对入侵物种进行早期检测和快速响应的重要性，以降低生态风险并防止新种群的建立。

传统监测方法，如拖网、水下调查和形态学鉴定，常常难以检测低丰度或隐匿性物种。相比之下，环境DNA（eDNA）分析通过水样中的微量遗传物质进行物种识别，不仅具有高灵敏度，还避免了对生物体的直接采集。eDNA的宏条形码分析和定量PCR（qPCR）技术已经在生物多样性评估和入侵物种监测中展现出显著优势，使得这些方法能够与生态系统调查相结合，揭示之前被忽视的物种分布模式。

本研究开发并验证了一种针对 *A. aspersa* 的特异性qPCR检测方法，并将其应用于全国范围内的港口监测计划。该方法不仅在实验室条件下表现出高度的特异性和灵敏度，还在实际应用中展现了良好的性能。通过超过300份环境DNA样本的检测，我们发现 *A. aspersa* 的DNA浓度在夏季达到峰值，这与该物种的繁殖季节相吻合。此外，地理分析显示该物种的分布范围比之前记录的更为广泛，包括在济州岛和东部港口的新发现。

这些结果不仅验证了该qPCR方法的有效性，还为入侵物种的早期检测、风险评估和监测提供了有力支持。该方法的高灵敏度和特异性使其成为国家生物安全框架中的重要工具，有助于制定更有效的管理策略。同时，该研究还展示了eDNA为基础的诊断技术在管理海洋入侵物种方面的潜力，通过可扩展且非侵入性的监测策略，提高了对生物入侵的应对能力。

为了确保检测的准确性和可靠性，本研究采用了一系列严格的实验步骤。首先，我们从18个主要港口收集了海水样本，并在春季、夏季和秋季进行采样。每个港口选择两个子区域以最大化空间覆盖，每个子区域使用1.5升水采样器采集8升海水。为了保持样本的完整性，采集的水样在10摄氏度以下储存，直到过滤。过滤过程在12小时内完成，使用电气吸管进行处理。随后，样本经过300微米的尼龙网过滤以去除大块物质和浮游生物，再通过3微米的混合纤维素酯（MCE）膜进行进一步过滤。过滤后的样本被放置在无菌的1.5毫升微量离心管中，立即冷冻并在干冰上运输至实验室进行DNA提取。

DNA提取过程采用DNeasy Blood and Tissue试剂盒，按照制造商的说明进行操作，并进行了适当的调整以最大化eDNA的产量。提取的DNA被溶解在100微升的AE缓冲液中，并通过NanoDrop OneC分光光度计进行浓度和纯度的评估，随后在-20摄氏度下储存。在实验室条件下，我们使用了专有的专利技术（KR 10–2023–0000688）设计的引物和探针，这些引物和探针能够特异性地检测 *A. aspersa*，在对128种非目标物种的测试中未产生任何扩增信号，表明其具有极高的特异性。

qPCR反应在20微升的反应体积中进行，包含10微升的qPCRBIO探针混合物、5微升的eDNA模板、1微升的TaqMan探针、1微升的正向和反向引物以及2微升的DEPC处理水。热循环过程在Applied Biosystems StepOnePlus实时PCR系统上进行，条件为：初始95摄氏度下3分钟的变性，随后进行45次循环，每次循环包括5秒的95摄氏度变性和30秒的60摄氏度退火，最后在72摄氏度下进行7分钟的延伸。这一方法确保了实验的准确性和重复性，为后续的数据分析奠定了基础。

在实验性能方面，我们使用合成DNA标准品对目标序列进行梯度稀释，以生成标准曲线。结果显示，该方法具有良好的线性关系（R2 > 0.99）和高扩增效率（110.1%）。检测限（LOD）为12拷贝/反应，定量限（LOQ）为598拷贝/反应，表明即使在极低浓度下，该方法也能可靠地检测 *A. aspersa* 的DNA。此外，阴性对照样本始终未检测到任何扩增信号，进一步确认了该方法在污染控制方面的有效性。

数据分析和可视化过程采用了多种统计方法。所有分析基于水样原始的qPCR表格，并通过标准曲线进行归一化处理。仅保留明确报告为Ct值的数值，排除未确定或非数值字段。对于每个港口，Ct值通过中位数、四分位数范围（IQR）和范围进行总结，并以箱形图形式展示。为了比较不同年份（2019–2022）的检测模式，我们匹配了允许元数据的站点，并对每个港口和季节的Ct值进行了描述性统计分析，包括中位数、IQR和范围，并生成相应的箱形图。同时，我们还对相同站点的沉积板覆盖情况进行了总结，并与eDNA的Ct值进行对比，以评估一致性（较低的Ct值≈较高的eDNA浓度）。

在2022年的检测中，我们发现 *A. aspersa* 的覆盖情况在夏季显著增加。通过视觉评估调查，我们观察到夏季（6月至8月）的覆盖比例明显高于春季（4月）和秋季（10月），这支持了温度相关繁殖周期的假设。分析显示，Bieung（BU）和Tongyeong（TY）在夏季的覆盖情况存在显著差异，其中BU的覆盖比例较高且较为稳定，而TY的覆盖范围更广，这表明不同站点在附着过程中的动态差异以及本地环境因素的影响。

地理扩展分析进一步揭示了 *A. aspersa* 在韩国沿海的分布情况。历史记录表明，该物种最初局限于南部港口，如Tongyeong及其相邻的港口。然而，我们的3年数据集（2019–2021）显示其分布范围正在逐步扩大，包括首次在济州岛（85%样本阳性，平均Ct值为18.0）的发现，以及在传统调查中未报告的其他港口。检测强度在人工结构密集和航运频繁的港口最为显著，这表明人为传播途径，如船体附着和压载水，可能是该物种扩散的主要驱动力。

本研究还确认了eDNA与沉积板调查之间的一致性。物种特异性qPCR方法生成的eDNA模式与沉积板观察结果相吻合：Ct值较低的港口通常表现出较高的 *A. aspersa* 覆盖。BU和TY成为快速附着人工基质的热点区域。尽管空间覆盖在不同年份有所变化（由于项目执行的限制），但2022年夏季的分析表明，该专利方法（KR 10–2023–0000688）能够提供用于早期检测和优先级排序的决策相关信号。

此外，该研究还探讨了该方法在不同季节和港口的扩展应用。通过更多季节和港口的覆盖，我们能够更全面地验证该方法的性能，并进一步支持其在生物入侵监测中的应用。未来，随着时间/季节重复和多港口覆盖的增加，将能够进行更正式的假设检验和更强的推论。这一模式在图S6中进一步可视化，其中较低的Ct值对应较高的沉积板覆盖，显示了该方法在空间和时间上的有效性。

本研究还确认了该方法能够检测生物体和非生物体的环境DNA。正向信号表明 *A. aspersa* 的DNA存在，但不一定意味着活体成虫的存在。然而，多个季节和空间上不同的港口中的一致检测结果强烈支持了该物种已建立种群的假设。将物种特异性分子检测方法整合到全国范围的港口监测计划中，展示了eDNA诊断技术如何补充甚至增强传统的监测手段。这种方法不仅有助于早期检测，还支持风险评估，并提供可操作的数据用于生物安全和管理框架。

通过这一研究，我们发现eDNA技术在监测海洋入侵物种方面具有巨大的潜力。它能够以非侵入性的方式，实现对生物多样性和入侵物种的可扩展监测。此外，随着eDNA检测技术的不断进步，诸如基于CRISPR/Cas12a的平台（如SHERLOCK、DETECTR和SENTINEL）等新技术正在成为qPCR的有力替代品，提供了快速、高特异性和可在现场部署的检测方法。虽然这些技术未在本研究中应用，但它们代表了生物监测的未来方向，可能被整合到未来的海洋入侵物种监测框架中。

总之，本研究开发了一种针对 *A. aspersa* 的高灵敏度和高特异性qPCR检测方法，并将其应用于韩国沿海的环境样本。该方法揭示了 *A. aspersa* 在季节和空间上的显著分布模式，为国家生物安全框架提供了有效的工具。同时，研究结果表明，eDNA技术能够检测到传统方法难以发现的隐匿性种群，有助于制定更有效的管理策略。这些发现不仅扩展了我们对 *A. aspersa* 生态学和扩散机制的理解，还为全球范围内监测海洋入侵物种提供了重要的参考。