自噬体标记物LC3通过几种不同的途径释放到细胞外

《FEBS Open Bio》：Autophagosome marker, LC3, is released extracellularly via several distinct pathways

自噬介导的分泌通过释放胞内成分维持细胞稳态，但其机制仍不明确。本研究开发HiBiT/NanoBiT技术，结合CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建LC3B-HiBiT稳转细胞株，并探究ATG5、FIP200基因敲除及BafA1处理对LC3分泌的影响。结果表明，BafA1抑制溶酶体功能可显著增加LC3分泌，且该过程依赖ATG5和FIP200介导的自噬体形成；突变LC3B的C端脂质修饰位点（ΔG）或受体结合域（K51A/L53A）可降低分泌效率，提示自噬依赖性分泌需LC3二聚化及受体结合。同时发现部分LC3-I通过非自噬途径分泌。该高灵敏度系统为解析自噬分泌机制提供了新工具。

　　自主吞噬是一种重要的细胞过程，通过将细胞质中的物质运输至溶酶体进行降解，维持细胞内部的稳态。这一机制在所有真核生物中普遍存在，包括酵母和人类。在自主吞噬过程中，隔离膜逐渐延伸并包裹目标物质，形成一个称为自噬体的细胞器。随后，自噬体与溶酶体融合，其内部的物质被降解。尽管自主吞噬通常在营养缺乏条件下被激活，但选择性自噬能够移除特定的细胞成分，并在细胞稳态维持中发挥关键作用。然而，关于自主吞噬的分泌机制仍存在许多未知之处，特别是LC3（自噬体标志物）如何被释放到细胞外，以及这一过程是否依赖于特定的条件或途径。

本研究利用HiBiT标签与NanoBiT技术开发了一种超高灵敏度的检测系统，以分析触发LC3分泌的条件，并探讨其分泌途径。通过构建HiBiT标签融合的LC3敲入细胞，研究人员观察到HiBiT依赖的NanoLuc荧光素酶活性（HiBiT活性）在细胞培养上清液中存在，但其水平低于CD63。HiBiT活性仅在加入去垢剂后才可检测到，表明LC3是从脂质膜中释放出来的。当使用bafilomycin A1（BafA1）处理细胞时，细胞外的HiBiT活性显著增加，而ATG5或FIP200敲除细胞中该活性则被抑制，说明LC3的释放依赖于自噬体的形成。然而，这些敲除细胞中仍能检测到一定量的HiBiT-LC3，表明LC3可能通过非自噬途径被释放。此外，C端截断（ΔG）或K51A/L53A突变也减少了LC3的释放，但并未完全阻止，这提示LC3的释放可能涉及多种途径。这项研究系统有助于揭示自主吞噬相关分泌的机制。

LC3是哺乳动物细胞中自噬的关键成分，其结构与酵母中的ATG8类似。在哺乳动物细胞中，已经鉴定出六种LC3蛋白：LC3A、LC3B、LC3C、GABARAP、GABARAPL1和GABARAPL2。LC3最初以前体形式（proLC3）合成，其C端的22个氨基酸被半胱氨酸蛋白酶ATG4切割，形成LC3-I。随着自噬过程的进行，LC3-I通过ATG3、ATG5、ATG7、ATG10、ATG12和ATG16L1等酶的系统作用，与磷脂酰乙醇胺（PE）结合形成LC3-II。LC3-II被锚定在自噬体膜上，并分布在膜的内外表面。当自噬体与溶酶体融合时，LC3-II在内膜中被降解，而外膜上的LC3-II则被ATG4切割为LC3-I。LC3-I与LC3-II的比例与自噬体膜的数量相关，因此LC3-II常被用作自噬活性的可靠标志物。此外，在选择性自噬中，LC3与自噬受体如p62、核点蛋白52?kDa和optineurin直接相互作用，以识别目标物质。这种分子机制的破坏与神经退行性疾病、癌症、细菌感染和炎症等疾病的发生有关。

近年来，一种新的自噬分泌途径被发现，即细胞质成分通过自噬机制被运输并分泌到细胞外，而不是进入溶酶体。这种分泌途径可能在溶酶体功能受损时被激活，作为一种补偿机制，通过释放细胞质成分或特定靶分子到细胞外来维持细胞稳态。LC3和自噬受体主要被分泌到小的细胞外囊泡（EV）中，而不是被包裹在膜结合囊泡中的大EV。此外，由于核心ATG因子的缺陷会降低自噬分泌，因此自噬依赖的分泌可能发生在细胞内降解过程中。该途径还与无信号肽的因子分泌有关，例如金属蛋白酶抑制剂1、白细胞介素-1β和铁蛋白等。然而，关于自噬的许多方面仍然不清楚，包括自噬是否发生在正常细胞中、触发自噬的具体条件以及不同靶物质的分泌程度。

本研究通过构建HiBiT标签融合的LC3B敲入细胞，利用CRISPR/Cas9技术对细胞进行基因编辑，以分析LC3B的分泌行为。HiBiT-LC3B敲入细胞通过将HiBiT标签与LC3B的N端融合，成功建立了敲入细胞系。此外，研究人员还通过基因编辑敲除了ATG5和FIP200基因，以研究其对LC3B分泌的影响。ATG5是LC3脂质修饰的关键因子，而FIP200是自噬体形成的上游因子。Western blot分析显示，在饥饿条件或BafA1处理下，HiBiT标签仅在HiBiT敲入细胞中被检测到，这表明HiBiT标签确实与LC3B融合。此外，在ATG5敲除细胞中未观察到LC3-II的形成，而在FIP200敲除细胞中，LC3-II的形成受到显著抑制。同时，ATG5或FIP200敲除细胞中自噬底物p62的积累也比野生型细胞更明显。这些结果表明，LC3的脂质修饰在自噬过程中起着关键作用。

进一步研究发现，HiBiT-LC3B在细胞培养上清液中被检测到，并且其分泌受到细胞外环境的影响。在饥饿条件下，LC3B的分泌率较低，而在BafA1处理后显著增加。这一现象表明，BafA1处理会破坏溶酶体功能，从而促进LC3B的分泌。此外，研究人员还通过不同的离心步骤，将培养上清液分为不同的部分，并检测其中HiBiT活性的变化。结果显示，HiBiT-LC3B主要分布在10k沉淀物（10k ppt）中，并且在加入去垢剂后其活性显著增加，这表明LC3B被包裹在脂质膜中并以囊泡形式分泌。而在100k上清液（100k sup）中，HiBiT-LC3B的活性不受去垢剂影响，表明其可能以非包裹形式存在。这一发现有助于理解LC3B的分泌机制。

研究人员还进一步分析了不同LC3家族成员的分泌情况。LC3家族包括LC3A、LC3B、LC3C、GABARAP、GABARAPL1和GABARAPL2。通过构建HiBiT标签融合的各成员表达载体，并在不同条件下进行瞬时表达分析，研究人员发现所有LC3家族成员都可能以类似的方式被分泌到细胞外。其中，LC3B的分泌率在BafA1处理后显著增加，且其分泌依赖于脂质修饰。此外，通过K51A和K51A/L53A突变体的分析，研究人员发现LC3B与自噬受体的结合可能在LC3B的分泌中起作用。尽管这些突变体减少了LC3B与自噬受体的结合能力，但在某些情况下仍能检测到其分泌，这表明LC3B的分泌可能涉及多种机制。

研究还探讨了LC3B的脂质修饰和自噬体形成在分泌过程中的作用。通过分析ATG5或FIP200敲除细胞，研究人员发现BafA1处理后LC3B的分泌受到抑制，表明自噬体的形成对LC3B的分泌至关重要。然而，在稳态条件下，LC3B的分泌率并未显著降低，这表明可能存在其他非自噬依赖的分泌途径。此外，研究人员还发现，LC3B的分泌不仅包括脂质修饰的LC3B-II，还包括未修饰的LC3B-I，这进一步支持了LC3B通过多种途径被分泌的观点。

在讨论部分，研究人员总结了LC3B分泌的五种可能机制：一是通过自噬体与细胞膜融合的自噬分泌途径；二是通过非自噬但脂质修饰依赖的途径，如LC3B-II的囊泡分泌；三是通过自噬受体介导的途径，如LC3B-I的分泌；四是通过非脂质修饰且不依赖自噬受体的途径，如LC3B-I的分泌；五是通过溶酶体的直接分泌。这些机制可能在不同的细胞条件下发生作用，从而形成复杂的分泌网络。

本研究的成果为理解自噬相关分泌提供了新的视角。通过HiBiT标签和NanoBiT技术的结合，研究人员能够以高灵敏度检测LC3B的分泌情况，并揭示其在不同条件下的变化。这不仅有助于研究自噬的分子机制，还可能为相关疾病的治疗提供新的思路。未来的研究可以进一步探讨自噬相关信号通路对LC3分泌的影响，以及不同自噬相关蛋白在分泌过程中的具体作用。