Bothrops蛇毒的N-糖蛋白组学特征揭示了进化上保守和差异性的表型

《Journal of Radiology Nursing》：N?Glycoproteomic Portraits of Bothrops Snake Venoms Reveal Evolutionarily Conserved and Divergent Phenotypes

糖基化是蛇毒蛋白后翻译修饰的重要部分，本研究系统分析了七种Bothrops蛇毒的糖基化特征，采用质谱技术结合 lectin blotting发现所有N-糖基化肽均来自酶蛋白，且糖链以fucose和sialic酸为主。不同蛇种在糖基化位点占用和糖链结构复杂性上存在显著差异，与进化分支和生态位相关。糖基化多样性通过影响蛋白结构和功能，为蛇毒进化提供了分子机制。

　　### 一、研究背景与意义

蛇毒作为一种复杂的生物分子混合物，长期以来被视为天然产物研究的重要资源。这些毒液不仅具有独特的生物学活性，还在进化过程中形成了高度特化的分子结构，用于捕食和防御。蛇毒的复杂性主要来源于其蛋白质成分的多样性，包括酶类和非酶类成分，以及它们的蛋白异构体（proteoforms）和浓度动态变化。然而，尽管蛇毒的结构和功能已经引起了广泛的关注，其中一些关键特征仍需要更深入的探索。

蛋白糖基化是蛇毒中一种重要的翻译后修饰（post-translational modification, PTM），它不仅增加了蛋白质的多样性，还可能影响其生物学活性。糖基化是一种非模板驱动的修饰过程，因此其调控机制和对毒液蛋白组的潜在影响仍存在许多未知。在蛇毒中，糖基化模式具有显著的多样性，包括不同类型的N-糖链结构、不同分支程度、不同的唾液酸化（sialylation）和岩藻糖基化（fucosylation）等特征。这些差异不仅反映了毒液蛋白组的复杂性，还可能揭示蛇毒在进化过程中适应不同生态环境的分子机制。

此外，糖基化在蛇毒蛋白的功能调节中扮演着关键角色。例如，糖基化可以影响蛋白质的折叠、溶解性、抗蛋白酶降解能力、血浆半衰期和免疫原性。因此，研究糖基化在蛇毒中的分布和功能意义，有助于更全面地理解毒液的生物学特性和进化适应性。本研究聚焦于七个Bothrops属蛇毒的N-糖基化模式，通过综合分析中性糖含量、凝集素印迹（lectin blot）和质谱技术，揭示了N-糖基化在毒液蛋白组中的作用及其与毒液功能多样性之间的关系。

### 二、研究方法概述

本研究采用了一系列先进的分析方法，以全面评估Bothrops属蛇毒的N-糖基化特征。首先，通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）和还原、非还原条件下的蛋白电泳分析，比较了不同毒液的分子质量分布。这一方法能够直观地展示蛋白在不同糖基化状态下的电泳行为，从而推测其糖基化水平。

其次，通过中性糖含量测定方法（phenol-sulfuric method），定量分析了毒液中的糖基化程度。这种方法适用于测定不同糖基化类型的总中性糖含量，但无法区分具体的糖基化模式。因此，为了进一步揭示毒液中糖基化结构的多样性，研究还使用了五种具有不同特异性的凝集素（lectins），包括MAA（对α-2,3-唾液酸-半乳糖有特异性）、SNA（对α-2,6-唾液酸-半乳糖有特异性）、DSA（对Gal-1,4-GlcNAc有特异性）、GNA（对甘露糖有特异性）和PNA（对Gal-1,3-GalNAc有特异性），通过凝集素印迹分析，进一步揭示了毒液中糖基化结构的分布特征。

此外，为了鉴定毒液蛋白中的N-糖基化位点及其对应的糖链组成，研究采用了基于质谱的分析方法。具体来说，使用了TiO?亲和色谱法（affinity chromatography）和亲水相互作用色谱法（hydrophilic interaction chromatography, HILIC）来富集糖肽（glycopeptides）。这些富集后的糖肽被分为两个部分进行分析：一部分通过PNGase F酶解糖基化后进行LC-MS/MS分析；另一部分则直接分析完整的糖基化肽。通过将这些糖肽信息与已知的N-糖链数据库结合，利用GlycReSoft软件进行谱图搜索，从而鉴定出N-糖基化位点及其糖链组成。

为了进一步分析糖基化位点的分布和功能意义，研究还结合了不同的生物信息学工具，如PatternLab用于去除完全相同的序列，以及Python编程工具进行聚类分析。这些方法的综合应用，使得研究能够从多个角度探讨Bothrops属蛇毒中糖基化的作用。

### 三、研究结果与分析

#### 3.1 蛇毒蛋白电泳图谱与中性糖含量分析

研究首先通过SDS-PAGE分析了七种Bothrops属蛇毒的蛋白图谱，发现不同毒液的分子质量分布存在显著差异。例如，在还原条件下，B. alcatraz、B. cotiara、B. fonsecai、B. insularis和B. jararaca的毒液中出现了明显的50 kDa蛋白带，而B. jararacussu和B. moojeni的毒液中则表现出不同的蛋白分布特征。在非还原条件下，这些毒液的蛋白带迁移位置相似，但其中一些毒液（如B. jararacussu和B. moojeni）表现出不同的糖基化模式。

此外，通过中性糖含量测定，研究发现所有毒液中的中性糖含量均处于0.03至0.04 μg/μg蛋白的范围内，表明这些毒液的糖基化水平相近，但糖链结构可能不同。这一结果提示，虽然中性糖含量相似，但不同毒液中糖基化模式的差异可能源于糖链结构的多样性，而不仅仅是糖基化程度的高低。

#### 3.2 凝集素印迹分析糖基化结构

为了进一步揭示毒液中糖基化结构的多样性，研究使用了五种凝集素进行印迹分析。其中，MAA和SNA主要用于检测唾液酸化的糖链结构，而DSA、GNA和PNA则分别用于检测不同类型的糖链。结果表明，MAA在B. alcatraz、B. cotiara、B. fonsecai、B. insularis和B. jararaca的毒液中显示出较强的反应性，而SNA在所有毒液中均未检测到任何反应。这表明这些毒液中主要存在α-2,3-唾液酸-半乳糖结构，而缺乏α-2,6-唾液酸-半乳糖结构。

DSA和GNA的印迹结果则显示了毒液中糖基化结构的进一步差异。例如，B. jararacussu和B. moojeni的毒液中检测到更多的糖基化结构，而B. alcatraz、B. cotiara、B. fonsecai、B. insularis和B. jararaca的毒液中则表现出不同的糖基化特征。这些结果进一步支持了毒液中糖基化结构的多样性，同时提示了不同毒液之间可能存在不同的糖基化模式。

#### 3.3 N-糖基化位点的鉴定策略

为了鉴定毒液中的N-糖基化位点，研究采用了两种不同的策略：一种是基于糖肽的完整分析，另一种是基于去糖基化肽的分析。具体来说，毒液蛋白首先经过胰蛋白酶（trypsin）水解，然后通过TiO?亲和色谱法和HILIC色谱法进行糖肽富集。这些富集的糖肽被分为三组（F1、F2和F3），其中F1主要富集于具有高亲水性的糖肽，F2则富集于带有唾液酸的糖肽，而F3则可能包含其他类型的糖肽。

为了提高鉴定的准确性，研究将F1、F2和F3中的糖肽分为两部分进行分析：一部分用于完整的糖肽分析，另一部分则用于去糖基化肽的分析。通过将去糖基化肽的序列信息作为数据库来源，结合GlycReSoft软件进行谱图搜索，研究成功鉴定了多个N-糖基化位点及其对应的糖链组成。这一方法的结合，使得研究能够更全面地了解毒液中糖基化位点的分布及其对毒液蛋白组的影响。

#### 3.4 完整糖肽与去糖基化肽的对比分析

通过对比完整糖肽和去糖基化肽的分析结果，研究发现，尽管所有毒液中都存在N-糖基化位点，但不同毒液中的糖基化模式存在显著差异。例如，B. jararacussu和B. moojeni的毒液中检测到最多的N-糖基化肽，而B. fonsecai的毒液中则检测到最少的N-糖基化肽。这一结果提示，不同毒液中的糖基化程度可能存在差异，但这种差异可能更多地体现在糖链结构的多样性上，而非糖基化位点的数量。

此外，研究还发现，所有毒液中的N-糖基化肽中，约50%的序列在不同毒液之间具有重叠性，而其余的则为特定毒液所特有。这一结果表明，虽然毒液中存在一定的保守性，但糖基化模式的差异仍然显著。特别是，在某些毒液中，N-糖基化位点的分布可能与毒液的功能多样性有关。

#### 3.5 N-糖基化在毒液中的异质性

研究进一步探讨了N-糖基化在毒液中的异质性。通过计算不同毒液中N-糖链结构的多样性指数（heterogeneity ratio），研究发现，不同毒液中N-糖基化位点的分布存在显著差异。例如，B. jararacussu和B. moojeni的毒液中，N-糖基化位点的多样性指数较高，而B. fonsecai的毒液中则较低。这表明，不同毒液中的N-糖基化模式可能受到不同的进化压力和环境因素的影响。

此外，研究还发现，不同毒液中的N-糖链结构可能与毒液的功能相关。例如，唾液酸化（sialylation）和岩藻糖基化（fucosylation）是毒液中N-糖链的常见特征，而高甘露糖型（high-mannose type）的N-糖链则相对较少。这提示，毒液中糖基化结构的多样性可能与毒液的功能多样性有关，而不仅仅是糖基化程度的高低。

#### 3.6 N-糖基化对毒液蛋白组的影响

研究还探讨了N-糖基化对毒液蛋白组的影响。通过分析不同毒液中N-糖基化肽的分布，研究发现，不同毒液中的蛋白组存在显著差异。例如，B. jararaca和B. jararacussu的毒液中，N-糖基化肽的分布与毒液的蛋白组密切相关，而B. alcatraz和B. insularis的毒液中则表现出不同的模式。这一结果表明，N-糖基化可能在不同毒液的蛋白组中起到不同的作用，可能是毒液功能多样性的关键因素之一。

此外，研究还发现，某些毒液中的N-糖基化肽可能具有不同的功能。例如，某些N-糖基化肽可能与毒液的毒理作用相关，而另一些则可能与毒液的结构稳定性或抗蛋白酶降解能力有关。这些不同的功能特征，可能使得N-糖基化成为毒液蛋白组复杂性的关键来源之一。

#### 3.7 非糖基化肽的分析

除了N-糖基化肽的分析，研究还对非糖基化肽进行了深入探讨。通过LC-MS/MS分析，研究发现，不同毒液中的非糖基化肽存在显著差异。例如，B. jararaca的毒液中检测到最多的非糖基化肽，而B. alcatraz的毒液中则检测到最少的非糖基化肽。这一结果提示，不同毒液中的非糖基化肽可能与毒液的蛋白组多样性有关，也可能与毒液的某些特定功能相关。

此外，研究还发现，不同毒液中的非糖基化肽可能具有不同的结构特征。例如，某些非糖基化肽可能与毒液的蛋白组多样性相关，而另一些则可能与毒液的某些特定功能有关。这些不同的非糖基化肽，可能在毒液的生物学作用中起到不同的角色。

#### 3.8 糖基化与非糖基化肽的对比分析

通过对比糖基化肽和非糖基化肽的分析结果，研究发现，毒液中糖基化和非糖基化肽的分布存在显著差异。例如，某些毒液中的糖基化肽可能与毒液的功能相关，而非糖基化肽则可能与毒液的结构稳定性或抗蛋白酶降解能力有关。此外，某些毒液中的糖基化肽可能具有不同的功能，如诱导细胞凋亡或影响蛋白折叠过程。

研究还发现，不同毒液中的糖基化肽和非糖基化肽的分布模式可能与毒液的进化历史有关。例如，B. jararacussu和B. moojeni的毒液中，糖基化肽的分布模式与非糖基化肽的分布模式存在一定的相似性，而其他毒液则表现出不同的模式。这一结果提示，毒液中糖基化和非糖基化肽的分布可能受到不同的进化因素的影响。

### 四、讨论与结论

本研究通过多种方法揭示了Bothrops属蛇毒中N-糖基化模式的多样性及其对毒液蛋白组和功能多样性的影响。研究发现，不同毒液中的N-糖基化位点和糖链结构存在显著差异，这可能与毒液的功能多样性有关。例如，某些毒液中的糖基化结构可能与其毒理作用密切相关，而另一些则可能与其蛋白折叠过程或抗蛋白酶降解能力有关。

此外，研究还发现，N-糖基化在毒液中并非普遍存在，而是主要集中在某些酶类成分中，如金属蛋白酶（SVMPs）和丝氨酸蛋白酶（SVSPs）。这些酶类成分的糖基化可能对其功能产生重要影响，如影响其与底物的相互作用或增强其在宿主体内的半衰期。因此，N-糖基化可能在毒液的生物学作用中起到关键作用。

研究还发现，毒液中N-糖基化结构的多样性可能与毒液的进化历史有关。例如，某些毒液中的糖基化结构可能受到其特定的生态环境和捕食习惯的影响。此外，研究还发现，不同毒液中的糖基化结构可能与毒液的蛋白组多样性相关，从而影响其功能多样性。

最后，研究指出，N-糖基化可能是一种重要的分子机制，用于调节毒液的结构和功能。然而，由于N-糖基化是一种非模板驱动的修饰过程，其调控机制和对毒液功能的具体影响仍需进一步研究。此外，研究还提到，糖基化可能在毒液的进化过程中起到重要作用，如通过改变蛋白质的折叠方式或与宿主细胞的相互作用，影响毒液的毒理效果。

综上所述，本研究通过多种方法揭示了Bothrops属蛇毒中N-糖基化模式的多样性及其对毒液蛋白组和功能多样性的影响。研究结果不仅有助于更全面地理解蛇毒的生物学特性，还为毒液的进化机制提供了新的视角。未来的研究可以进一步探讨N-糖基化在毒液中的具体功能，以及其在毒液进化中的作用机制。