NLN（非淋巴细胞因子）的缺失通过下调GPX4的m6A甲基化来诱导铁死亡（ferroptosis），从而抑制肺癌的进展

《Redox Biology》：Loss of NLN suppresses lung cancer progression by inducing ferroptosis through downregulating m6A methylation of GPX4

铁死亡调控新靶点NLN在非小细胞肺癌中的致癌机制及小分子抑制剂NR2的开发。

肺癌，尤其是非小细胞肺癌（NSCLC），占所有肺癌病例的约85%，并且是全球癌症相关死亡的主要原因。尽管在靶向治疗和免疫治疗方面取得了显著进展，但晚期NSCLC患者的五年生存率仍然较低，这突显了开发创新治疗策略的迫切需求。肺癌的异质性和复杂的分子机制要求我们探索新的分子靶点，以期获得更有效的治疗方案。近年来，铁死亡作为一种新的调控性细胞死亡形式，因其在肿瘤抑制中的潜在作用而受到关注。铁死亡主要由细胞内抗氧化系统调节，其中谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）在减少脂质过氧化物、防止铁死亡中发挥关键作用。GPX4的抑制会导致脂质过氧化物的积累，从而引发铁死亡。因此，调控关键蛋白如GPX4以调节铁死亡成为癌症治疗的一种有前景的策略。

在本研究中，我们通过高通量蛋白质组学技术识别了神经肽酶（NLN）作为NSCLC的新治疗靶点。NLN是一种线粒体金属蛋白酶，传统上被认为参与神经肽的降解以及线粒体功能的调节。近期研究开始揭示其在癌症中的作用，尤其是在急性髓系白血病（AML）中，NLN被证实支持肿瘤的存活，通过调节线粒体呼吸链超复合物的形成。然而，NLN在实体瘤，如NSCLC中的作用仍未被充分研究，这表明我们对NLN潜在致癌功能的理解仍存在显著空白。通过挖掘公共癌症数据库，我们发现NLN可能在肺癌进展中起关键作用，可能通过调节细胞增殖、迁移和对细胞死亡的抵抗力等关键过程。鉴于线粒体是活性氧（ROS）产生及铁代谢的主要场所，其在铁死亡的诱导中发挥核心作用。

本研究进一步探讨了NLN在肺癌细胞铁死亡调控中的作用。通过使用稳定的shNLN细胞系进行纳米孔测序，我们观察到NLN的缺乏显著富集了铁死亡相关路径，这表明NLN与铁死亡之间存在紧密联系。在铁死亡相关因素的评估中，我们发现NLN的缺乏导致GPX4的表达显著减少，而SLC7A11和NQO1的上调可能与GPX4的抑制形成反馈机制。此外，ACSL4的表达增加可能与多不饱和脂肪酸的合成有关。通过整合mRNA和蛋白层面的变化，我们提出NLN的缺乏通过调控GPX4的表达来诱导铁死亡，但NLN的过表达并未显著增强GPX4的表达，这表明NLN可能通过调控GPX4的翻译后水平影响其表达。通过使用Actinomycin D进行mRNA稳定性实验，我们发现NLN的缺乏导致GPX4 mRNA在2小时内迅速降解，并在9小时后几乎完全降解，这表明NLN通过影响GPX4 mRNA的稳定性来调控其表达。

我们进一步验证了NLN在肺癌细胞中通过降解GLX4 mRNA诱导铁死亡的机制。通过使用RNA点印和meRIP-qPCR技术，我们发现NLN的缺乏显著降低了GPX4 mRNA的m6A修饰水平，导致其不稳定并最终引发铁死亡。在分析中，我们还发现NLN的缺乏与m6A修饰水平的降低相关，而m6A修饰水平的动态变化主要由“写入器”（甲基转移酶）、“擦除器”（去甲基酶）和“读取器”（结合蛋白）共同调控。通过过表达甲基转移酶METTL3并使用FTO抑制剂FB23-2，我们能够调节细胞内的m6A水平，并确认NLN通过抑制细胞内的m6A修饰来调控GPX4的表达，导致其mRNA降解并最终诱导铁死亡。

我们进一步开发了一种针对NLN的特异性小分子抑制剂NR2，并验证了其在体外和体内对肺癌细胞的治疗效果。NR2通过调控NLN的活性，能够有效诱导肺癌细胞死亡。通过体外和体内实验，我们发现NR2能够显著抑制肺癌细胞的生长，并对肿瘤细胞产生良好的治疗效果。此外，我们通过BODIPY C11染色和GPX4表达检测，确认NR2能够诱导肺癌细胞的铁死亡。这些发现不仅表明NLN是NSCLC中调控铁死亡的关键调节因子，还为靶向铁死亡治疗肺癌提供了新的策略。我们的研究为NLN靶向治疗在NSCLC中的临床开发奠定了科学基础，解决了药物耐受性和肿瘤进展等挑战。

研究还发现，NR2的治疗效果在体内实验中得到了验证。通过使用小鼠模型进行治疗实验，我们发现NR2能够显著抑制肿瘤的生长，并延缓肿瘤的进展。此外，我们通过组织学分析和流式细胞术，评估了NR2在小鼠模型中的安全性和有效性。NR2治疗期间，小鼠体重无显著变化，组织学结构也未受到明显影响。这些结果表明，虽然NR2可能在体内引起某些参数的轻微变化，但并未导致严重的毒副作用，从而确认了其在小鼠模型中的初步安全性。此外，通过评估NR2在不同细胞死亡抑制剂下的效果，我们发现其能够显著增强铁死亡诱导的细胞死亡，从而确认其作为铁死亡诱导剂的有效性。

综上所述，我们的研究揭示了NLN在NSCLC中的潜在致癌性，并阐明了其通过调控GPX4表达诱导铁死亡的分子机制。我们进一步探讨了NLN作为肺癌治疗靶点的临床价值，这可能为肺癌的临床转化提供科学依据。尽管已有许多关于NLN特定抑制剂的报道，但很少用于后续研究以开发其临床价值，目前也没有商业可用的抑制剂。因此，基于现有文献，我们合成了特定的NLN抑制剂NR2，并通过体外和体内实验验证了其对肺癌细胞的治疗效果。这些研究不仅为NLN作为NSCLC治疗靶点的临床应用提供了研究基础，还为肺癌的治疗提供了新的方向和可能性。未来的研究应优先进行小鼠模型中的药代动力学实验，提高NR2的转化潜力。此外，还应在体外进行生化实验，评估NR2与NLN的结合亲和力，从而确认这一相互作用的特异性。同时，还应启动与传统肺癌靶向治疗的联合治疗研究，以探索管理这种疾病的新策略。