含有四唑结构的萘基双磺酰胺类Keap1-Nrf2相互作用抑制剂，其结合模式出乎意料

《Redox Biology》：Tetrazole-containing naphthalene bis-sulfonamide Keap1-Nrf2 interaction inhibitors with unexpected binding modes

本研究合成并表征了系列naphthalene bis-sulfonamides化合物，发现化合物25以低纳摩尔Kd（≤1 nM）高亲和力结合Keap1，存在cis和trans两种构象，其中cis形式通过极性相互作用更紧密结合，但trans形式在溶液中更稳定。化合物25有效激活Nrf2通路及抗氧化基因表达，但需高浓度细胞活性。研究揭示了磺酰胺类化合物与Keap1的构象异构特性及结合机制，为药物开发提供新方向。

　　在最新的研究中，科学家们对一类称为萘双磺酰胺的化合物进行了深入探讨。这类化合物被广泛研究，因其能够抑制Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）与核因子erythroid 2相关因子2（Nrf2）之间的相互作用，而Keap1是一种促进泛素化反应的蛋白质，Nrf2则是一种与多种细胞保护反应相关的转录因子。这些化合物通过与Keap1的C末端Kelch结构域结合，并占据Nrf2的结合位点，从而导致Nrf2的积累，进而增强其在细胞中调控抗氧化反应元素基因的表达。通过一系列X射线晶体学、结合实验和细胞实验，研究团队揭示了这些化合物的结合模式及其对Nrf2的激活作用。

此外，研究还对化合物的构象变化进行了分析，利用核磁共振（NMR）技术在溶液中观察到其具有两种不同的旋转构型——顺式（cis）和反式（trans），这两种构型在溶液中都存在并可以相互转化。分子动力学模拟进一步表明，顺式构型与Keap1之间的相互作用能量更低，但反式构型在溶液中更为稳定。这种反式构型的高稳定性可能与其在溶液中较低的结合能有关。此外，该化合物在Keap1上的结合能力很强，表现出低纳摩尔量级的解离常数（Kd），表明其非标准的结合模式可能在高亲和力的形成中起到了关键作用。

研究还指出，对于这一系列结构相似的化合物，在研究其结构-活性关系（SAR）时需要特别谨慎，因为它们的结合模式可能存在差异。这一发现对进一步开发这类化合物具有重要意义，特别是在其作为非电亲性Nrf2诱导剂或用于蛋白质降解靶向嵌合体（PROTACs）的应用方面。该研究不仅提供了关于这些化合物在分子层面的结合模式的详细信息，还揭示了其在细胞环境中的作用机制，为未来药物设计和优化提供了重要的理论支持。

从合成方法来看，研究人员采用了多种化学反应来制备对称和不对称的萘双磺酰胺化合物。对称的双磺酰胺结构通常由萘化合物通过硝化和胺化反应得到，而不对称结构则通过引入不同的取代基，如酯基、酰胺基或四唑基，来实现其特定的结合模式。在这些合成过程中，研究人员使用了包括SnCl2·2H2O、DMF、乙酸酐、碳酸氢铵、二甲基亚砜（DMSO）等多种试剂和条件，以确保化合物的高效合成和纯化。

为了进一步验证这些化合物的结合特性，研究人员采用了一系列生物物理和生物化学实验方法。例如，通过荧光偏振（FP）实验、差示扫描荧光（DSF）实验、等温滴定量热（ITC）实验和微尺度热泳（MST）实验，评估了它们对Keap1的结合亲和力。这些实验结果表明，化合物25表现出最高的结合亲和力，其Kd值低于1纳摩尔，这使其成为目前已知的Keap1结合物中亲和力最强的化合物之一。同时，研究人员还通过X射线晶体学对化合物25与Keap1的结合模式进行了分析，发现其在结合位点上可以同时占据顺式和反式构型，这种现象与之前的研究结果不同，表明其具有独特的结合特性。

在细胞实验中，研究人员进一步评估了化合物25的生物学活性。通过使用Hepa1c1c7细胞系，他们发现该化合物能够显著诱导Nrf2靶基因的表达，包括NQO1、HO-1、GstP、Gclm和Gclc等。此外，通过细胞热泳实验（CETSA），研究人员确认了化合物25在细胞内的靶向结合能力，表明其能够影响Keap1的热稳定性，并促进Nrf2的激活。这些结果不仅揭示了化合物25的高亲和力，还强调了其在细胞内靶向结合的重要性。

为了进一步理解化合物25的结合模式及其在溶液中的构象变化，研究人员还利用NMR技术对化合物进行了详细分析。NMR数据表明，化合物25在溶液中存在两种互变的构型，且其在不同温度下的分布比例发生了变化。结合分子动力学模拟，研究人员发现顺式构型在结合Keap1时具有更高的亲和力，这可能与其与多个极性残基（如ARG380、ARG415和ARG483）形成更广泛的极性相互作用有关。相比之下，反式构型在溶液中更稳定，但其结合亲和力可能不如顺式构型。

这些发现对于进一步开发Keap1-Nrf2蛋白-蛋白相互作用抑制剂具有重要意义。它们表明，分子的构象变化和结合模式可能对其生物活性产生重要影响，因此在药物设计和优化过程中需要充分考虑这些因素。此外，研究还强调了在结构-活性关系（SAR）分析中，对结构相似化合物的结合模式进行细致研究的必要性，以避免错误的假设和设计偏差。

总的来说，这项研究不仅揭示了化合物25在Keap1-Nrf2相互作用中的高亲和力和生物活性，还为理解这一类化合物的结合机制提供了新的视角。研究结果对未来的药物开发和优化具有重要的指导意义，特别是在开发具有更高亲和力和选择性的Nrf2诱导剂或PROTACs方面。同时，研究也提醒研究人员在进行SAR分析时，应更加谨慎地考虑化合物的构象变化和结合模式，以确保药物设计的准确性和有效性。