热带适应肉牛品种血浆蛋白质组学揭示蜱抗性生物标志物及分子机制

《BMC Genomics》：Blood plasma proteomics for detecting potential biomarkers for tick resistance in a tropically adapted beef cattle breed

本研究针对热带地区牛蜱侵染导致严重经济损失的问题，通过LC-MS/MS技术对高/低蜱载量的Caracu牛血浆蛋白质组进行比较分析，鉴定出152个差异表达蛋白（RES组101个上调，SUS组51个上调）及206个组别特异性蛋白。功能富集发现36个生物过程、35个分子功能和16条通路显著富集，涉及止血平衡、囊泡运输、钙信号等关键机制。PPI网络揭示ALB、EP300等62个核心节点蛋白，首次系统揭示热带牛种蜱抗性分子基础，为抗蜱育种提供新靶点。

　　

在热带地区的牛肉 cattle（牛）生产中，蜱虫侵染是一个令人头疼的难题。小小的蜱虫，特别是Rhipicephalus (Boophilus) microplus（微小扇头蜱），不仅能引起皮肤损伤、贫血、体重下降，还会传播疾病，甚至导致牛只死亡，造成巨大的经济损失。在热带气候区，蜱虫繁衍更为迅速，问题尤为突出。传统的控制方法主要依赖化学杀螨剂，但长期使用不仅导致蜱虫产生抗药性，还带来环境污染和动物产品残留等问题。尽管疫苗研发取得了一些进展，但其保护效果和成本仍是挑战。因此，通过遗传育种筛选出天然抗蜱的牛只，被认为是更可持续的解决方案。

然而，在育种项目中直接进行蜱虫计数来评估抗性，不仅费时费力，也难以大规模应用。了解牛对蜱虫抗性的分子机制，特别是寻找可靠的生物标志物（Biomarker），成为关键。此前，已有一些基因组学和转录组学研究揭示了部分相关基因，但蛋白质作为生命活动的直接执行者，其层面的研究仍较为缺乏。血液血浆（Blood Plasma）作为与全身组织相互作用的“信息中转站”，能够更早地反映机体对侵染的响应，是寻找生物标志物的理想样本。

本研究聚焦于一种热带适应的牛品种——Caracu牛。该品种由16世纪葡萄牙殖民者带来的伊比利亚半岛牛种杂交选育而成，经过长期的自然选择，对高温、食物短缺和寄生虫表现出极强的适应性和抗性，被认为是热带地区宝贵的牛种资源。此前研究表明，Caracu牛对蜱虫的抗性介于抗性较强的瘤牛（Bos indicus）和易感性较高的欧洲牛（Bos taurus）之间，在热带适应当地牛种中表现出色。为了深入探究其抗蜱的分子奥秘，研究人员对经过严格表型鉴定的Caracu母牛进行了血浆蛋白质组学分析。

本研究采用了以下关键技术方法：首先，对162头自然感染蜱虫的Caracu母牛进行了为期18个月共8次的蜱虫计数，根据平均计数筛选出极端表型个体（8头高抗性RES和8头高易感SUS）用于后续分析。其次，采集血液样本并分离血浆，利用Cibacron Blue琼脂糖珠去除高丰度白蛋白（Albumin）以提升低丰度蛋白检测灵敏度。随后，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术进行蛋白质鉴定和定量，使用Trans-Proteomic Pipeline（TPP）软件套装进行数据处理，以log-fold change ≥1 或 ≤-1 且 P < 0.05为标准筛选差异表达蛋白。最后，利用DAVID数据库进行基因本体（GO）和通路（KEGG/REACTOME）富集分析，并通过STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络以识别关键节点蛋白。

顶部差异丰度蛋白质

研究人员在16个Caracu牛血浆样本中共检测到14,034种蛋白质。质量控制后，在SUS组和RES组中分别独家鉴定出172个和34个蛋白质。此外，还发现了152个差异丰度蛋白质，其中51个在SUS组血浆样本中显著增加，101个在RES组中显著增加。

在差异最显著的前20个蛋白质中，一些蛋白质的功能可能与对微小扇头蜱侵染的响应相关。在SUS组中过丰度的蛋白质包括TNS2（张力蛋白-2）、NOXO1（NADPH氧化酶组织者1）、ZNRF3（锌指和环指结构域3）、KMT2B（组蛋白赖氨酸甲基转移酶2B）、RPS6KA5（核糖体蛋白S6激酶A5）、TMEM63A（跨膜蛋白63A）、MAST2（微管相关丝氨酸/苏氨酸激酶2）和SETD1B（SET结构域包含1B）。这些蛋白质涉及细胞迁移、增殖、ROS（活性氧）产生、WNT信号通路（一条参与组织稳态和修复的重要通路）、造血作用（血细胞生成）和炎症调控等过程。在RES组中过丰度的蛋白质包括RNASE1（核糖核酸酶A家族成员1，胰腺）、SETD2（SET结构域包含2）、HP（触珠蛋白）、C4BPA（补体成分4结合蛋白α）、PON1（对氧磷酶1）和APOA4（载脂蛋白A4）。这些蛋白质在血管稳态、组织修复、造血干细胞维持、抗氧化、抗炎、脂质代谢以及补体和凝血系统中发挥重要作用。例如，触珠蛋白（HP）是公认的急性期蛋白，在宿主对感染和炎症的免疫防御中起关键作用。

功能富集分析

功能富集分析揭示了36个显著（P < 0.05）的GO生物过程（GO_BP）、35个GO分子功能（GO_MF）和16条通路。这些显著富集的条目主要涉及以下几个可能与蜱抗性相关的方面：

止血平衡（Hemostasis）：包括补体系统激活（如GO:0006956）、经典补体激活途径（GO:0006958）、血小板脱颗粒（R-BTA-114608）和补体与凝血级联通路（bta04610）等。补体和凝血系统是宿主抵御蜱虫叮咬的第一道防线，血凝块的形成可以阻碍蜱虫吸血，而补体系统参与炎症反应和病原体清除，可能直接导致蜱虫排斥或吸血失败。

囊泡运输（Vesicular Transport）：特别是内吞作用（bta04144）和吞噬作用的正调控（GO:0050766）。吞噬作用对于清除病原体和组织碎片至关重要，有效的吞噬能力有助于宿主在叮咬后快速修复损伤。

细胞增殖与迁移（Cell Proliferation and Migration）：如体细胞干细胞群体维持（GO:0035019）、上皮细胞增殖（GO:0050673）和细胞迁移调控（GO:0030334）等过程。Hippo信号通路（R-BTA-2028269）的富集也与此相关，该通路调控组织稳态、修复和免疫反应。这些过程对于将免疫细胞招募至叮咬部位、促进炎症消退和组织愈合至关重要。

钙信号（Calcium）：钙离子在血小板激活、细胞信号转导和宿主防御中起核心作用。细胞内钙浓度升高是血小板激活和聚集的关键步骤，也可能保护皮肤免受蜱虫附着。

肌动蛋白（Actin）：肌动蛋白丝结合（GO:0051015）参与细胞骨架重塑、细胞运动和血小板功能，所有这些在应对蜱虫叮咬造成的组织损伤和启动修复过程中都不可或缺。

脂质与脂蛋白（Lipids and Lipoproteins）：多项与胆固醇外流、高密度脂蛋白（HDL）颗粒组装和重塑、磷脂代谢等相关的生物学过程和通路被富集。脂质水平与免疫反应密切相关，寄生虫感染会影响宿主血脂水平。

清道夫受体（Scavenger Receptors）：结合和摄取配体通路（R-BTA-2173782）的富集提示这些模式识别受体在宿主-病原体相互作用和免疫调节中可能发挥作用。

过氧化氢（Hydrogen Peroxide）：过氧化氢catabolic process（GO:0042744）的富集表明氧化应激响应参与其中，H₂O₂在细胞信号和伤口愈合中作为信号分子。

酪氨酸（Tyrosine）：酪氨酸代谢（bta00350）和蛋白酪氨酸磷酸酶活性（GO:0004725）被富集。高浓度的酪氨酸对吸血节肢动物具有毒性，可能影响蜱虫存活。

胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factor）：IGF运输和摄取的调控通路（R-BTA-381426）被富集，IGF系统在组织修复和免疫细胞趋化中起作用。

蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

PPI网络分析包含356个节点和457个相互作用边，平均局部聚类系数为0.357，富集显著性P < 1x10^-16。根据中心性和连接度，确定了62个重要节点蛋白。

这些关键节点蛋白包括ALB（白蛋白，36个连接）、EP300（组蛋白乙酰转移酶p300，22个连接）、SETD2（14个连接）、APOA2（载脂蛋白A-II，13个连接）、AHSG（α2-HS糖蛋白，12个连接）、HP（触珠蛋白，12个连接）、APOA1（载脂蛋白A-I，11个连接）、KMT2B（11个连接）等。它们广泛参与上述富集的生物过程和通路，例如ALB、APOA1、APOA2、APOA4、HP、C4BPA、SERPINA1等与止血、脂质转运和免疫调节密切相关；FLNA、ITGA1、ITGB3、ITGA4等与细胞迁移和粘附有关；KMT2B、SETD2、SETD1B、EP300、KAT6A、SMARCA4等与表观遗传调控和基因表达相关。这表明蜱抗性是一个由多个功能模块协同作用的复杂网络状系统。

研究结论与意义

本研究通过比较热带适应牛种Caracu的蜱抗性（RES）和易感性（SUS）个体之间的血浆蛋白质组，首次系统揭示了该品种应对微小扇头蜱侵染的分子机制。研究鉴定出大量差异表达蛋白和组别特异性蛋白，其中RNASE1、TNS2、APOA4、PON1、C4BPA、HP、SETD2等蛋白因其在血管稳态、组织修复、抗氧化、抗炎、补体激活和脂质代谢等方面的功能，被认为是潜在的关键生物标志物。

功能富集分析表明，蜱抗性牛的免疫应答更倾向于一种平衡、有效的调控模式，特别是在止血平衡（通过补体和凝血系统的有效激活）、细胞清除与组织修复（通过增强的吞噬作用和细胞迁移能力）以及代谢调节（如脂质稳态）方面表现出优势。而易感牛则可能表现出更强烈的、但可能效率较低或失衡的应激反应，例如在细胞增殖、迁移相关信号通路和钙信号方面蛋白表达更高，这可能是为了应对更严重的组织损伤而进行的代偿性努力。

PPI网络分析进一步确认了多个处于网络中心位置的关键蛋白，如ALB、APOA1、C4BPA、HP等，它们作为枢纽连接着不同的功能模块，强调了这些蛋白在整合不同生理过程以形成有效抗性中的核心地位。

该研究的重要意义在于：1）深化了对热带适应当地牛种蜱抗性分子基础的理解，揭示了从蛋白质层面调控的关键生物过程和通路；2）鉴定出的潜在生物标志物为未来开发用于抗蜱育种的高通量筛选技术（如基于蛋白质或多肽的检测方法）提供了重要的候选靶点，有助于降低对直接表型测量的依赖；3）为理解宿主-寄生虫相互作用的复杂机制提供了新的视角；4）研究结果有望应用于跨品种验证，并为进一步研究（如基因编辑、疫苗开发或新型防控策略）提供理论基础。当然，这些潜在的生物标志物仍需在更大规模的动物群体、不同牛种中利用替代技术进行验证，以确立其在牛育种计划和蜱虫综合防控策略中的实际应用价值。