综述：治疗性体内基因组编辑：基于rAAV载体的CRISPR递送技术的创新与挑战

《Gene Therapy》：Therapeutic in vivo genome editing: innovations and challenges in rAAV vector-based CRISPR delivery

本综述系统探讨了重组腺相关病毒（rAAV）载体递送CRISPR系统进行体内治疗性基因组编辑的最新进展。文章重点分析了如何通过使用超紧凑型Cas直系同源物（如CjCas9、SaCas9）、双rAAV载体系统以及蛋白质/RNA反式剪接等创新策略，克服rAAV有限包装容量（<4.7 kb）的挑战，从而实现碱基编辑器（BE）、引导编辑器（PE）等大型CRISPR工具的高效体内递送。同时，综述也深入探讨了AAV衣壳工程、高保真CRISPR平台开发以及应对免疫原性等关键挑战，展望了其在遗传病治疗中的巨大潜力与临床转化前景。

　　

INTRODUCTION

CRISPR-Cas系统是一项革命性的基因组编辑技术，其治疗应用正被广泛探索用于治疗多种遗传性疾病。CRISPR-Cas系统治疗应用的一个重要里程碑是美国FDA批准了Casgevy，这是首个基于CRISPR的离体疗法。Casgevy通过编辑患者造血干细胞中BCL11A基因的红系特异性增强子，重新激活胎儿血红蛋白表达，从而治疗严重镰状细胞病和输血依赖性β-地中海贫血。此外，最近利用脂质纳米颗粒（LNP）介导的碱基编辑纠正严重氨甲酰磷酸合成酶1缺乏症的临床进展，进一步凸显了CRISPR技术的治疗潜力。这些临床试验表明，疾病相关症状和输血需求显著减少。本综述总结了基于重组AAV（rAAV）载体的体内CRISPR应用的最新进展，重点讨论其治疗应用、新兴策略、载体创新、临床进展以及将这些方法转化为安全有效的遗传病治疗方法所必须解决的挑战。

CRISPR-BASED GENOME EDITING MECHANISMS

CRISPR-Cas系统源自微生物的适应性免疫机制，通过称为引导RNA（gRNA）的小RNA进行序列特异性引导。在CRISPR介导的基因组编辑中，两种关键的RNA，即CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（tracrRNA），被转录以指导靶标识别。为了提高基因组编辑效率，通过连接crRNA和tracrRNA开发了嵌合单链引导RNA（sgRNA）。Cas9:gRNA复合物识别特定的原型间隔区相邻基序（PAM）序列，诱导基因组中的双链断裂（DSB）。在诱导DSB后，细胞内的DNA修复通路如非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）被激活。NHEJ通常在切割位点产生小的插入或缺失（indel），而HDR则可以利用同源DNA模板进行精确的遗传修饰。这些通路被用来引入靶向的遗传修饰。

CRISPR-BASED PRECISION GENOME EDITING TOOLS

重编程Cas蛋白进行位点特异性DNA识别的能力，促进了不依赖DSB的高级基因组编辑平台的发展。碱基编辑器（BE），如胞嘧啶碱基编辑器（CBE），通过整合胞苷脱氨酶，促进胞嘧啶（C）向胸腺嘧啶（T）（或鸟嘌呤（G）向腺嘌呤（A））的转换。类似地，腺嘌呤碱基编辑器（ABE）通过腺苷脱氨酶实现A向G（或T向C）的转换。这些进步实现了不诱导DSB的精确核苷酸替换，从而最大限度地减少了潜在的脱靶效应并提高了基因组编辑的特异性。

随后开发的引导编辑器（PE）能够进行更多样化的基因组修饰。PE由Cas9切口酶与逆转录酶融合而成，允许在不诱导DSB的情况下靶向引入精确编辑。prime editing guide RNA（pegRNA）将PE蛋白引导至靶位点并提供所需基因组编辑的模板。然而，PE的效率仍然不理想，当前的研究旨在提高其效率并拓宽其适用性。

RECOMBINANT AAV VECTORS FOR IN VIVO CRISPR DELIVERY

rAAV载体是高效、安全的体内基因递送的有吸引力的工具。大量独立的临床试验和已批准的基因治疗产品已证明其治疗各种疾病的强大潜力。与其他病毒载体相比，rAAV载体具有若干优势，主要源于其非致病性，这使得其在临床使用中更安全。其次，rAAV载体主要在细胞内以附加体形式持续存在，确保在靶器官中实现持久的转基因表达。动物研究和新兴的人体数据表明，转基因表达可以持续十年以上。这种治疗反应的持久性对于长期治疗的成功至关重要，特别是因为基于rAAV载体的疗法无法用相同血清型的载体再次给药。此外，rAAV载体引发的免疫反应较低，先天炎症通路和适应性免疫（包括中和抗体产生和细胞毒性T细胞反应）的激活有限，从而使它们能够在细胞中长期存在。最后，rAAV载体表现出高组织趋向性，有助于将转基因高效递送至靶器官。

尽管有这些优势，rAAV载体有限的包装容量（<4.7 kb）仍然是体内递送CRISPR组件的一个重大挑战。为解决这一问题，已开发出多种策略，包括利用紧凑的Cas直系同源物和合理设计rAAV载体。这些方法提高了递送效率，并拓宽了治疗适用性。本文综述了rAAV介导的CRISPR基因组编辑的最新进展，这些进展有助于克服尺寸限制，实现CRISPR工具的更高效递送，并扩大可治疗遗传病的范围。

RAAV VECTOR-MEDIATED CRISPR CLINICAL TRIALS

在各种研究的递送平台中，rAAV载体因其良好的安全性、广泛的组织趋向性和长期转基因表达能力，已成为体内治疗应用最广泛的系统之一。这些特性使rAAV载体特别适合将CRISPR工具直接递送到靶组织中，通过全身或局部给药实现精确的基因组编辑。基于离体策略的成功，体内CRISPR疗法正朝着临床实现迈进。EDIT-101是首个进入人体试验的体内CRISPR疗法，其靶向CEP290基因的IVS26突变，该突变导致10型莱伯先天性黑蒙症（LCA10），一种严重的遗传性视网膜疾病。通过视网膜下注射使用rAAV血清型5（AAV5）载体递送，EDIT-101将SpCas9和两个靶向IVS26突变侧翼内含子区域的gRNA直接递送到视网膜细胞中，切除异常的剪接供体位点，从而恢复正常的剪接和功能性CEP290表达。1/2期BRILLIANCE试验的早期结果显示，14名接受治疗的参与者中有11人安全性良好且光感受器功能改善，支持了rAAV载体介导的体内基因编辑在人类中的可行性。然而，观察到的有限疗效，加上目标患者群体较小，导致停止进一步招募患者并转向寻找开发伙伴。值得注意的是，这些临床进展凸显了CRISPR疗法在治疗先前难以治愈的遗传性疾病方面的潜力。rAAV载体介导的体内基因组编辑已证明的可行性进一步支持了其临床相关性，特别是对于靶向离体方法无法触及的组织。展望未来，系统评估和优化基于rAAV载体的递送平台，对于在广泛的遗传病谱系中实现安全、高效和组织特异性的CRISPR递送至关重要。

DEVELOPMENT OF RAAV VECTOR PLATFORMS FOR IN VIVO CRISPR DELIVERY

All-in-one rAAV vectors employing compact nucleases

rAAV载体的尺寸限制仍然是体内CRISPR递送的一个重大挑战。然而，使用紧凑型Cas变体为克服这一障碍提供了一种有前景的策略。超紧凑CRISPR系统的发现，如空肠弯曲菌Cas9（CjCas9）、金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）等，使得将CRISPR效应器、其gRNA以及必要的调控元件包装到单个rAAV载体中用于治疗应用成为可能（图1A和表1）。例如，在视网膜色素变性（RP）疾病模型RhoP23H/+小鼠中，视网膜下递送编码靶向Nr2e3基因的CasMINI_v3.1/ge4.1的rAAV8载体，在GFP阳性视网膜细胞中实现了超过70%的转导效率。注射后一个月，与对照组相比，光视b波值增加，表明视锥光感受器功能显著改善。又如，利用rAAV9载体递送源自脑膜炎奈瑟菌的紧凑型Nme2-ABE8e，以纠正FahPM/PM小鼠中导致遗传性酪氨酸血症1型（HT1）的Fah突变。尽管总体编辑效率相对较低（0.34%），但治疗成功恢复了6.5%的FAH阳性肝细胞，超过了修复十万分之一肝细胞的治疗阈值，证明了all-in-one rAAV介导的体内CRISPR递送的治疗潜力。

最近的进展已确定IscB和TnpB等效应器（现代Cas蛋白的推定祖先）作为有前景的超紧凑基因组编辑工具。由于其分子尺寸小，它们与rAAV载体的包装限制具有更好的兼容性，并且与常规CRISPR系统相比可能呈现降低的免疫原性。在临床前研究中，全身递送编码基于EnIscB-ωRNA的ABE的rAAV8载体，有效纠正了酪氨酸血症小鼠模型中Fah基因的致病突变。该治疗导致15%的编辑效率并恢复了Fah表达。在另一项研究中，在人源化DMD（hDMD）小鼠模型中，肌肉注射编码IscB.m16*-CBE的rAAV9载体导致30%的外显子跳跃和肌营养不良蛋白表达的恢复。此外，通过全身注射递送的编码靶向Pcsk9的TnpB的scAAV9载体在肝脏中实现了高达56%的编辑，并显著降低了血液胆固醇水平。这些发现凸显了AAV介导的小型CRISPR衍生平台在体内基因组编辑中的治疗潜力。

Dual-rAAV vectors for full-length CRISPR delivery

双rAAV载体编码CRISPR组件，其中Cas9核酸酶及其相应的gRNA在不同的载体上递送，旨在克服rAAV包装容量的限制。该策略能够递送全长的Cas核酸酶以及多个gRNA和/或大的HDR供体模板，从而拓宽了基因组编辑的治疗范围（图1B）。作为一个代表性应用，使用了两个rAAV9载体，一个编码SaCas9，另一个编码一个gRNA和一个跨越DMD基因外显子52-79的供体。这种方法通过精确的、不依赖同源性的靶向整合，在缺乏DMD外显子52的hDMD-KO小鼠的治疗肌肉中成功恢复了全长肌营养不良蛋白的表达。值得注意的是，在出生后第2天通过面部静脉注射进行全身递送，实现了3%的基因组校正和治疗组织中超过25%的肌营养不良蛋白转录本的恢复，强调了基于双rAAV载体的编辑在体内大片段插入方面的治疗潜力。尽管有这些进展，两种载体有效共转导到同一靶细胞中仍然是一个主要挑战，因为共递送不足会显著降低编辑效率。此外，大的CRISPR平台如BE和PE仍然超出rAAV载体的包装容量，阻碍了它们作为全长分子在该系统中的递送。

Dual-rAAV vectors for split delivery of CRISPR components

Protein trans-splicing rAAV vectors encoding split-CRISPR molecules.

蛋白质反式剪接rAAV载体平台代表了一种有前景的策略，通过采用内含肽介导的蛋白质重建策略，克服rAAV载体介导的大型CRISPR组件（如包含额外功能域的BE或PE）递送的包装限制。在该系统中，Cas9转基因被分割成N端和C端片段，每个片段包装到一个单独的rAAV载体中。当共递送并在同一靶细胞中表达时，两个蛋白质片段通过内含肽介导的剪接重新组装成功能性的全长蛋白质（图2A）。内含肽是自我催化的蛋白质元件，能够自我剪接，连接侧翼的外显肽以形成全长蛋白质。在剪接过程中，内含肽自我切除，通过肽键连接Cas9的N端和C端片段。

该策略已在若干临床前研究中证明了治疗效果（表2）。例如，使用分裂的CBE治疗由SOD1基因突变引起的肌萎缩侧索硬化症（ALS）。通过rAAV9分两部分递送，一部分编码与nCas9-NT融合的rAPOBEC1，另一部分编码nCas9-CT，CBE以两个半长蛋白质的形式表达，通过内含肽介导的蛋白质剪接重新组装成全长蛋白质（图2B）。该方法在SOD1基因实现了1.2%的编辑，改善了神经肌肉功能，并在ALS小鼠模型中减少了40%的SOD1免疫反应性包涵体。在另一应用中，使用内含肽介导的反式剪接rAAV9-CBE来纠正与C型尼曼匹克病相关的Npc1 c.3182T>C突变。在小鼠小脑中，未分选核中的编辑效率为0.3%，分选核中为42%。这导致寿命延长10%，浦肯野细胞存活改善，炎症减少，证明了该方法对中枢神经系统（CNS）疾病的治疗潜力。类似地，编码靶向Rpe65 R44X突变的ABEmax的反式剪接rAAV9载体在LCA（rd12）小鼠模型中实现了13.5%的编辑效率，恢复了视网膜中光诱导的电反应（图2C）。

这种蛋白质反式剪接rAAV载体系统也已成功应用于体内递送PE。在C57BL/6小鼠中，全身注射编码v3emPE的反式剪接rAAV9载体，在注射后八周在肝脏中对Pcsk9 Q155H实现了39%的编辑效率（图2D）。与未处理的对照组相比，该治疗导致血浆胆固醇水平降低20%。类似地，视网膜下递送编码靶向Pde6a D670G突变的PE的反式剪接rAAV2.NN载体，在小鼠视网膜中实现了9.4%的基因编辑，保留了视觉功能和光感受器完整性，同时改善了视网膜结构并支持功能恢复。在另一项研究中，视网膜下施用编码PE的反式剪接rAAV8载体，在携带Pde6b R560C突变的rd10小鼠的总视网膜细胞中实现了40.9%的编辑。这种编辑保留了光感受器细胞，改善了视网膜结构和功能，并恢复了PDE6活性，这对光转导和视觉至关重要。

总的来说，这些结果凸显了反式剪接rAAV介导的CRISPR递送在减缓疾病进展方面的潜力。然而，内含肽剪接效率可能因组织类型或疾病背景而异，这些方法存在一些局限性。此外，两种载体组分的有效共转导和适当的化学计量表达可能导致不完全的蛋白质重建。针对内含肽或错误折叠中间体的免疫反应也可能损害体内表达和稳定性。尽管如此，蛋白质反式剪接rAAV载体介导的CRISPR递送系统是扩展基于CRISPR的基因组编辑治疗适用性的一个多功能且强大的平台。

RNA trans-splicing rAAV vectors encoding split-CRISPR molecules.

与依赖蛋白质水平重建的蛋白质反式剪接rAAV载体不同，RNA反式剪接rAAV载体仅产生全长mRNA，不表达无功能或有害的中间体，并且在选择分割位点方面提供更大的灵活性，不受蛋白质折叠限制。RNA反式剪接方法已证明与BE和PE系统兼容，并已成功应用于各种组织，突显了其治疗性基因组编辑的多功能性（表3）。作为概念验证，开发了编码ABE的RNA反式剪接rAAV载体。5‘-半载体携带N端Cas核酸酶与TadA融合以及一个剪接供体（SD），而3’-半载体携带C端Cas核酸酶以及一个剪接受体（SA）和多聚腺苷酸（poly(A)）信号。共转导后，两个rAAV载体的ITR之间的同源重组介导了串联体形成，产生融合的载体基因组。跨越这些串联体的转录产生包含SD和SA序列的前mRNA转录本。内源性剪接体识别这些剪接位点并进行精确的RNA反式剪接，产生全长成熟的ABE mRNA，随后翻译成完整的ABE蛋白质（图3A）。

随后，在Dmd基因敲除小鼠中肌肉内递送反式剪接rAAV-ABE载体，在注射后八周实现了3.3%的编辑，将Dmd基因中的一个提前终止密码子纠正为野生型（图3B）。这种靶向编辑在17%的肌纤维中恢复了肌营养不良蛋白的表达，证明了该系统的功能功效。基于此方法，另一项研究利用RNA反式剪接rAAV9载体在PS19小鼠（一个携带MAPT-P301S突变的tau蛋白病变模型）中递送NG-ABE8e。颅内给药在海马细胞中实现了5.7%的编辑效率，导致不溶性tau聚集体和磷酸化tau水平显著降低。值得注意的是，与模拟对照组相比，治疗小鼠表现出认知能力的显著改善。此外，RNA反式剪接rAAV载体的实用性已扩展到用于rd12小鼠递送的PE系统（图3C）。视网膜下施用编码PE组分的rAAV8载体在视网膜色素上皮细胞中产生了6.4%的编辑效率，恢复了Rpe65表达并显著改善了视觉功能。RNA反式剪接rAAV-CRISPR系统的使用突显了其治疗潜力。然而，精确的载体设计，包括优化剪接信号和ITR同源区，对于确保一致和高效的基因组编辑性能至关重要。

基于这些发现，开发了基于mRNA反式剪接的rAAV载体方法，即通过mRNA反式剪接重建（REVeRT）来递送CRISPR组件。在该系统中，双rAAV载体各自转录一个单独的前mRNA。5‘载体携带一个启动子、Cas核酸酶的NT编码序列、SD和结合域（BD）。3’-半载体携带一个启动子、一个SA、C端Cas核酸酶和BD。rAAV载体共转导后，前mRNA通过其互补的BD杂交，使工程化的SD和SA并置。这种相互作用促进了反式剪接事件所需的物理接近。此过程导致成熟全长mRNA的重建及其随后翻译成完整的CRISPR蛋白质（图4）。在野生型小鼠中，REVeRT介导的rAAV8载体递送分裂的dCas9-VPR在多个组织（包括视网膜、海马、肝脏、肺、心脏和骨骼肌）中实现了稳健的重建，导致Myo7b基因的有效反式激活（图4）。

总的来说，REVeRT系统证明了在mRNA水平实现重建的可行性，而不依赖于ITR介导的重组。其效率很大程度上取决于结合域和剪接位点结构的合理设计，这对于确保精确剪接和最大限度地减少异常或无功能的转录本至关重要。

ENGINEERING AAV CAPSIDS FOR TARGETED IN VIVO CRISPR DELIVERY

rAAV载体表现出组织特异性趋向性，已被用于靶向肌肉、肝脏和中枢神经系统（CNS）等器官进行治疗性基因递送。然而，这种趋向性并非绝对，大多数AAV血清型对肝脏表现出强烈的偏好。这种肝脏趋向性虽然对肝脏靶向治疗有用，但对旨在靶向肝外组织的全身递送构成了重大挑战，因为它会减少到达预期靶标的载体比例。此外，它还引起了对治疗功效降低以及脱靶毒性和免疫反应风险的担忧。为克服这些限制，已开发出一系列rAAV衣壳工程策略以增强组织特异性。例如，将7-mer PHP.B肽插入AAV1衣壳（通过基于文库的定向进化鉴定），在静脉递送携带CRISPRa的AAV1-PHP.B后，能够有效穿透血脑屏障并增强小鼠大脑中的CNS转导。该方法导致小鼠脑组织中内源基因（如Camk2a、Nrf2和Keap1）的稳健转基因激活。类似地，同样通过基于文库的定向进化获得的肌肉趋向性变体AAVMYO，与常规血清型AAV9相比，显示出卓越的骨骼肌靶向性，同时显著减少了肝脏中的脱靶表达。同时，合理设计方法已产生诸如myoAAV等变体，这些变体表现出增强的肌肉特异性和减少的脱靶生物分布。

最近，机器学习引导的方法（如Fit4Function）使得能够设计具有增强肝脏趋向性和跨物种预测性能的多特性rAAV衣壳，在人肝细胞中实现了相对于rAAV9载体高达1000倍的转导效率。这些进展突显了基于文库的方法、合理设计和人工智能驱动的工程在生成用于精确和安全体内CRISPR递送的下一代rAAV方面的潜力。

ENGINEERING HIGH-FIDELITY CRISPR PLATFORMS FOR RAAV VECTOR DELIVERY

提高CRISPR系统的保真度对于增强rAAV载体递送疗法的安全性至关重要。广泛的蛋白质工程已产生高保真（HF）变体，包括eSpCas9、SpCas9-HF1和efSaCas9。类似地，下一代BE（如ABE8e-V106W和eCBE）整合了点突变，可在不显著降低效率的情况下减少在意外基因组位点的脱靶编辑。PE虽然通常与比核酸酶或BE更少的脱靶活性相关，但仍通过优化pegRNA支架等方式持续受益于保真度的改进。最近的改进，如mpegRNAs的开发，通过减少不希望的indel同时保持编辑效率，进一步提高了编辑精度。总的来说，这些进展表明，开发高保真核酸酶、BE和PE，以及优化gRNA结构，是确保rAAV载体递送的CRISPR疗法特异性的关键策略，特别是随着这些系统向临床应用推进。

OVERCOMING IMMUNOLOGICAL CHALLENGES OF RAAV VECTORS FOR CRISPR-BASED THERAPIES

对rAAV载体和CRISPR组分的免疫反应是体内基因组编辑疗法长期成功的重大障碍。rAAV载体虽然通常被认为具有低免疫原性，但仍可引发强烈的免疫反应，尤其是在对AAV衣壳蛋白存在预先存在的中和抗体（NAb）的个体中。此外，即使没有预先存在的免疫力，宿主免疫系统也可能在rAAV载体给药后产生适应性免疫反应。针对表达外源蛋白（如细菌来源的CRISPR酶）的转导细胞的细胞免疫反应，可能导致细胞毒性T淋巴细胞（CTL）介导的清除已编辑细胞。这不仅限制了治疗益处的持续时间，而且由于炎症或组织损伤而引发安全性担忧。

为克服这些免疫障碍，正在积极寻求几种互补策略。一种方法侧重于通过蛋白质工程改造Cas核酸酶上的免疫原性表位，开发免疫原性较低的Cas变体，从而降低与主要组织相容性复合物（MHC）的结合亲和力并减弱细胞毒性T细胞反应的诱导。第二种策略采用自消除rAAV设计，其中Cas9靶向载体基因组，从而限制长期表达并实现载体的自我失活。衣壳工程代表了另一个主要工具，用于生成能够逃避预先存在的NAb的rAAV变体。此外，免疫抑制方案，如皮质类固醇或靶向免疫调节剂，已被用于减少宿主免疫反应并延长载体持久性。最后，非病毒纳米颗粒和细胞外囊泡等替代递送载体正在成为可递送CRISPR系统的免疫逃避平台。总的来说，这些策略解决了免疫相容性问题，以扩大rAAV-CRISPR疗法在不同患者群体中的适用性和持久性。

Challenges

尽管rAAV载体介导的CRISPR递送系统取得了显著进展，但仍存在一些必须解决的挑战，以确保临床安全性和治疗精确性。主要担忧之一源于载体相关风险的内在属性。最近关于高剂量全身施用rAAV载体后患者死亡的报告突显了持续的安全性问题，包括在Danon病、Rett综合征、X连锁肌管肌病和DMD的试验中发生的死亡事件。这些病例通常与免疫介导的毒性、肝衰竭或全身炎症反应有关，凸显了对诸如改进趋向性和安全性特征的AAV衣壳工程、优化给药方案和短暂免疫抑制等策略的迫切需求。此外，FDA最新通讯和指南所体现的不断发展的监管反应，反映了对正在进行的和未来试验中长期安全性监测和风险效益评估的日益重视。解决这些发展对于就系统性rAAV载体基因治疗的安全性挑战提供平衡和最新的视角至关重要。

CONCLUSIONS

基于rAAV载体的CRISPR-Cas系统递送在体内治疗应用中具有巨大潜力。载体设计的创新，包括紧凑型Cas核酸酶、双载体系统和反式剪接方法，通过克服与载体包装容量和靶向精度相关的关键限制，显著扩展了rAAV载体介导的基因组编辑的范围。这些进步使得能够在多样的临床前模型中进行精确的基因组编辑，为将这些技术转化为临床环境奠定了坚实的基础。尽管有这些进展，对rAAV载体和CRISPR组分的免疫反应仍然是广泛临床实施的主要障碍。对AAV血清型的预先存在的免疫力会降低载体转导效率，而载体给药后的免疫激活可能限制治疗效果的持续时间。此外，针对Cas9蛋白的免疫反应可能导致已编辑细胞的清除，削弱治疗效果。为克服这些挑战，当前的努力重点在于开发免疫原性较低的rAAV血清型、实施短暂免疫抑制方案以及设计免疫逃避的Cas9变体。这些策略对于确保rAAV-CRISPR疗法的安全性、有效性和长期成功至关重要。持续的跨学科研究和临床验证对于克服这些障碍并释放该平台的全部治疗潜力至关重要。