综述：呼吸道黏膜疫苗的进展与前景：机制、技术和临床应用

《npj Vaccines》：Advances and prospects of respiratory mucosal vaccines: mechanisms, technologies, and clinical applications

本综述系统阐述了呼吸道黏膜疫苗的最新进展，重点探讨了其诱导黏膜免疫（SIgA、TRM细胞）的独特优势，以及针对流感病毒、SARS-CoV-2和RSV的多种疫苗平台（如LAIV、腺病毒载体、VLP）的研发现状。文章深入分析了黏膜佐剂（如dmLT、TLR激动剂）和递送系统（如纳米颗粒、病毒载体）的关键作用，并指出了其在阻断感染和传播方面的巨大潜力，为应对新发呼吸道传染病提供了重要策略。

　　

呼吸道黏膜免疫的机制

呼吸道黏膜是抵御病原体入侵的第一道关键屏障。其免疫机制依赖于物理上皮屏障、先天免疫组分和适应性免疫的协同作用。

物理和上皮屏障由丰富的细胞群体构成，包括上皮细胞、内皮细胞和间充质细胞，它们共同建立了贯穿气道和肺组织的防御前线。气道腔表面广泛存在的黏液层由杯状细胞分泌，其主要成分包括黏蛋白、细胞因子、补体因子、抗菌肽、分泌型免疫球蛋白A（SIgA）和共生细菌。该层通过捕获和中和病原体来防止入侵，并作为物理和生化过滤器调节病毒进入。上皮细胞通过紧密连接、粘附连接和桥粒强化这一屏障，并通过分泌黏蛋白和抗菌肽以及协调纤毛运动清除病原体来参与先天免疫。

先天免疫组分包括肺泡巨噬细胞、非常规T细胞，尤其是先天淋巴样细胞（ILCs）。ILCs被分为ILC1、ILC2和ILC3亚群，是黏膜免疫的关键调节因子。抗原摄取主要通过三种途径进行：微皱褶细胞（M细胞）运输抗原至上皮下的树突状细胞（DCs）；上皮细胞回收抗原并将抗体递送至黏膜表面；DCs直接伸出树突跨上皮捕获抗原并迁移至引流淋巴结。

适应性免疫和黏膜记忆方面，B细胞活化依赖于生发中心中与滤泡辅助性T细胞（Tfh）的合作，经过体细胞高频突变和类别转换重组后，分化为分泌二聚体IgA（dIgA）的浆细胞。dIgA通过多聚免疫球蛋白受体（pIgR）跨上皮细胞运输，在管腔表面形成SIgA。SIgA在病原体入侵部位中和病原体，防止其粘附和传播。黏膜效应部位富含固有层中的淋巴细胞，其中组织驻留记忆T细胞（TRMs）在抗原进入部位留存， upon reinfection 提供快速、局部化的应答。

黏膜疫苗佐剂的发展

在疫苗配方中，佐剂被定义为能够增强抗原诱导的免疫反应的功能性辅助成分。它们通过多种机制提高疫苗的免疫原性，在亚单位和灭活疫苗中起着至关重要的作用。

佐剂可以改变抗原的物理特性，实现其缓慢释放，从而延长其在体内的存在时间。这种缓释效应有助于持续刺激免疫系统并维持长效的免疫应答。其次，佐剂可以吸附抗原，增加其表面积，使其更容易被抗原呈递细胞（APCs）摄取和处理，从而增强抗原摄取。佐剂还通过激活和促进APCs的成熟来显著提高抗原呈递效率，增强体液和细胞免疫，促进B和T细胞记忆的分化，从而促进适应性免疫的发展。此外，它们可以诱导细胞因子和趋化因子的释放，促进免疫细胞募集，进一步增强免疫激活。

大肠杆菌的热不稳定性毒素（LT）和霍乱毒素（CT）及其变体是最具代表性的类毒素佐剂。这些佐剂通过结合大多数有核细胞表面的GM1神经节苷脂受体，增强黏膜屏障通透性，促进局部APCs的募集和激活。最重要的是，当抗原在黏膜部位暴露时，它们可以有效诱导抗原特异性IgA抗体和长效记忆细胞。然而，由于其在动物模型中表现出毒性，其给药与贝尔氏麻痹（Bell's palsy）的发生率显著更高相关，因此LTK63（一种突变的LT佐剂）最终被撤市。

LThaK是热不稳定性毒素（LT）的解毒衍生物，其ADP-核糖基转移酶活性被抑制。经鼻内递送时，LThaK不会易位至中枢神经系统（CNS），表明其具有良好的安全性特征。I期（NCT03293732）和II期（NCT03784885）临床试验表明，用LThaK佐剂化的流感疫苗在两次鼻内给药后表现出显著的功效和良好的耐受性。

一些黏膜佐剂既表现出免疫刺激特性，又具有递送系统功能，例如壳聚糖及其衍生物。壳聚糖是从α-几丁质中提取的天然衍生物，因其黏膜粘附和免疫刺激能力而成为理想的黏膜佐剂选择。基于壳聚糖的纳米颗粒不仅能延长抗原在局部的滞留时间，还能增强抗原在黏膜的吸收并保护抗原免受黏膜环境中的降解。

黏膜疫苗递送系统

黏膜疫苗的递送系统在疫苗开发中起着至关重要的作用，特别是在递送重组蛋白和核酸疫苗等大分子抗原时。由于分子量大，这些抗原难以直接穿过复杂的黏膜屏障。因此，递送系统成为将抗原运输至适当位置以有效诱导免疫反应的重要工具。

在呼吸道黏膜中，抗原必须以颗粒形式呈递才能被APCs有效识别，从而激活局部和全身免疫反应。递送系统不仅能保护抗原免受黏液中的蛋白酶、核酸酶和SIgA的降解，还能延长抗原在黏膜表面的滞留时间，从而增强疫苗的免疫原性。近年来，基于黏膜粘附的纳米颗粒（NP）递送系统在黏膜疫苗领域引起了广泛关注。

纳米凝胶作为一种重要的聚合物颗粒，凭借其独特的水合聚合物结构，提供了强大的生物相容性和可控的抗原释放能力。它们可以通过提高抗原的稳定性来显著增强黏膜疫苗的免疫原性。免疫刺激复合物（ISCOMs）是由抗原、胆固醇、磷脂和皂苷佐剂Quil A组成的纳米颗粒。ISCOMs直径约为40纳米，用于递送疫苗抗原，并在经皮注射或黏膜给药后高效靶向免疫系统。

各种合成、半合成和天然聚合物已广泛应用于NP疫苗和药物递送系统的制备。这些聚合物纳米颗粒的尺寸范围通常为1-100纳米，并且由于其优异的生物相容性、生物可降解性、低毒性以及根据需要调整形状和尺寸的能力，已成为疫苗开发中理想的递送载体。

无机纳米颗粒由于其无毒、优异的生物相容性和高稳定性，已成为药物和疫苗递送的重要载体。它们具有独特的物理化学特性，如高表面积、光学和磁性特性，并且可以通过特定的配体修饰增强对靶细胞或分子的亲和力。无机纳米颗粒可以有效地保护封装抗原或药物免受降解，并通过控制释放机制减少药物剂量，从而降低毒性。

自组装颗粒凭借其结构稳定性和抗原呈递能力，成为黏膜疫苗设计中一种有前途的递送策略。例如，铁蛋白（ferritin）是一种自组装蛋白纳米颗粒，可以以重复且有序的方式展示病毒抗原，增强B细胞受体的交联和免疫激活。SpyCatcher/SpyTag技术允许将抗原模块化地、共价地连接到载体颗粒上，为抗原展示和快速疫苗开发提供了灵活性。

针对流感病毒的呼吸道黏膜疫苗

减毒活流感疫苗（LAIVs）的概念可以追溯到20世纪30年代，当时前苏联的A. A. Smorodintsev及其同事使用减毒病毒株开发了第一批鼻内流感疫苗。这些疫苗从20世纪60年代开始广泛使用，1987年，苏联成为世界上第一个批准三价冷适应LAIV的国家。经鼻黏膜给药的LAIV随后于2003年在美国被批准为三价制剂（LAIV3）。随着疫苗技术的进步，LAIV4（FluMist Quadrivalent, MedImmune）于2012年获得美国FDA批准，并于2013年获得欧洲药品管理局（EMA）批准。

研究表明，FluMist诱导的局部IgA抗体水平是传统灭活流感疫苗（如四价灭活疫苗）的两倍，其全身IgG抗体滴度也显著增加，保护率通常超过80%。其强大的局部免疫反应在阻止病毒进入人体方面具有显著优势，有效减少呼吸道感染的发生。相比之下，传统流感疫苗的保护率通常在60%至70%之间，对局部免疫反应的诱导较弱。该疫苗在儿童中表现尤为出色；在一项FluMist Quadrivalent疫苗的临床研究中，接种后血凝抑制（HAI）抗体的几何平均滴度（GMT）显著增加，尤其是在2-8岁无季节性流感疫苗接种史的儿童中。在接种第二剂后，HAI抗体滴度增加了四倍。在儿童中，减毒活疫苗LAIV对培养确认的流感预防率高达90%，并且在这个年龄组中比灭活制剂具有优势，尽管这种优势随着年龄的增长而减弱。

Nasovac-S是印度血清研究所（SIIL）基于俄罗斯主供体病毒技术开发的三价LAIV。该疫苗通过鼻喷雾剂给药，可以模拟自然感染途径，有效诱导呼吸道黏膜的局部免疫反应，特别是SIgA抗体的产生。这种黏膜免疫在阻止病毒进入黏膜屏障方面起着关键作用。此外，该疫苗还能诱导全身免疫反应，显著提高HAI抗体水平并刺激T细胞反应，使其在预防流感病毒感染方面非常有效。

除了冷适应和重配策略外，NS1蛋白截短或缺失已被开发为LAIV设计中的一种合理减毒方法。例如，一种基于PR8、截短NS1蛋白（仅保留前124个氨基酸）的流感病毒，通过未能拮抗I型干扰素而表现出自我佐剂效应，从而增强了CD8⁺ T细胞反应和对异源病毒株的交叉保护。

针对SARS-CoV-2（COVID-19）的呼吸道黏膜疫苗

腺病毒被认为是一种安全且经过充分研究的抗原递送平台，并在COVID-19疫苗开发中取得了成功。

AdCOVID是由美国公司Altimmune开发的一种鼻内COVID-19疫苗，采用腺病毒载体技术（Ad5）。目前处于临床前研究阶段，该疫苗通过鼻喷雾剂给药，旨在刺激呼吸道的局部免疫反应，特别是SIgA抗体的产生，以阻断SARS-CoV-2的早期进入。单次鼻内剂量的AdCOVID已被证明能有效诱导针对SARS-CoV-2的强大全身和黏膜免疫反应。

鼻内施用Gam-COVID-Vac（Sputnik V）在动物模型中显示出能诱导持久且强大的全身和黏膜免疫反应。在小鼠中，单次剂量可在至少180天内维持高水平的 neutralizing antibodies、血清IgG和强烈的T细胞反应。重要的是，鼻内制剂于2022年4月在俄罗斯以Salnavac的名称正式注册供人使用，标志着从临床前研究到实际应用的关键一步。

Convidecia Air（也称为Ad5-nCoV）是世界上第一个获批的呼吸道黏膜COVID-19疫苗。它使用复制缺陷型人5型腺病毒载体来递送SARS-CoV-2刺突蛋白基因。通过呼吸道黏膜雾化吸入给药，该疫苗不仅能提高肺特异性IgG和IgA抗体水平，还能激活组织驻留记忆T细胞，有助于在感染早期阻断病毒在呼吸道的复制和传播。

印度Bharat Biotech International Limited（BBIL）开发了一种名为BBV154的鼻内SARS-CoV-2疫苗，基于黑猩猩腺病毒载体。该疫苗编码一种预融合稳定的刺突蛋白，在S2亚基中引入了两个脯氨酸替代突变。这些突变有助于维持刺突蛋白的预融合构象，从而增强免疫系统识别病毒的能力，并增加疫苗诱导的中和抗体反应。

ChAdOx1 nCoV-19（也称为AZD1222）是由牛津大学和阿斯利康联合开发的一种复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体COVID-19疫苗。它编码SARS-CoV-2刺突（S）蛋白。动物研究表明，鼻内施用ChAdOx1 nCoV-19可有效预防仓鼠和非人灵长类动物（NHPs）的SARS-CoV-2感染。

2022年12月2日，鼻内流感病毒载体COVID-19疫苗（dNS1-RBD）被授予紧急使用授权。它是世界上第一个其安全性和广谱功效在III期临床试验中得到验证的黏膜COVID-19疫苗。该疫苗由冷适应甲型流感病毒株开发，其基因组中的非结构蛋白1（NS1）基因被删除，并通过基因重组插入了SARS-CoV-2的RBD基因。

NDV-HXP-S是西奈山伊坎医学院开发的一种新型COVID-19疫苗候选物。它利用新城疫病毒（NDV）（一种对人类无致病性的家禽病毒）作为载体，表达一种经过六次脯氨酸突变修饰以增强其稳定性和免疫原性的预融合稳定SARS-CoV-2刺突蛋白（HexaPro）。

一些黏膜SARS-CoV-2疫苗候选物整合了新一代佐剂，如TLR激动剂和环状二核苷酸（例如，cGAMP, c-di-GMP），以进一步增强黏膜免疫。这些药剂通过激活STING和TLR3/9等PRRs，导致强大的I型干扰素反应和IL-17产生的组织驻留记忆T细胞的诱导。

病毒样颗粒（VLPs）通过安全地模拟天然病毒结构并有效诱导鼻腔SIgA（抵抗感染的关键屏障），显示出作为抗SARS-CoV-2黏膜疫苗的强大潜力。鼻腔SIgA水平升高与Omicron感染风险降低相关，并且鼻内疫苗接种或突破性感染显著增强了黏膜抗体反应和对BA.1、BA.2和BA.5的交叉中和作用。

针对RSV的黏膜疫苗

减毒活疫苗在儿童中具有显著优势。与肌肉注射相比，鼻内给药对儿童更温和、更容易接受。这种黏膜免疫机制可能在防御RSV感染中发挥关键作用，因为鼻腔中较高水平的RSV特异性IgA通常与更强的保护作用相关。

目前，几家制药公司已采用减毒活疫苗作为RSV预防策略。其中，赛诺菲的RSVt疫苗候选物是最先进的。该疫苗通过删除NS2基因并引入聚合酶基因的温度敏感突变（△1313/I1314L）来实现减毒。

CodaVax-RSV是Codagenix开发的一种减毒活疫苗。其减毒机制基于密码子去优化，涉及系统改变病毒基因组中的同义密码子以降低宿主细胞中的蛋白质表达效率，从而削弱病毒的复制能力。这种方法在保持抗原表位的同时有效降低毒力，从而实现了安全性和免疫原性之间的平衡。

BLB201是Blue Lake使用副流感病毒5（PIV5）作为载体表达RSV F蛋白开发的一种嵌合病毒载体疫苗。该疫苗的首次I期临床试验在RSV血清阳性且年龄在33-75岁的成年人中进行。

黏膜疫苗的最新进展突出了重组流感病毒载体作为预防流感和RSV感染的双平台策略。RSV/Flu-01E基于通过去除NS1蛋白C端一半（NS1_124）而减毒的流感载体，并在截短的NS1开放阅读框内表达RSV融合（F）蛋白的保护性表位。

呼吸道黏膜疫苗的总结与展望

呼吸道黏膜疫苗在诱导局部和全身免疫反应方面显示出巨大潜力。值得注意的是，这种局部免疫激活促进了组织驻留记忆细胞的形成，使宿主 upon re-exposure to pathogens 能够快速产生特异性免疫反应。此类疫苗有望在上下呼吸道建立有效的免疫屏障，从而防止自身感染并有效阻断呼吸道病原体在人群中的传播。此外，呼吸道黏膜疫苗可能诱导交叉保护性免疫，这对于快速变异的病原体尤其有价值，从而提高了整体疫苗功效。

近年来，疫苗开发领域经历了重大转变——从传统的全细胞灭活和减毒疫苗转向佐剂亚单位疫苗以及更先进的平台，如病毒载体、RNA和DNA疫苗。这种转变有助于降低过度免疫反应的风险。因此，未来的努力应集中于将全细胞抗原与有效的黏膜佐剂相结合以提高疫苗接种效果。

目前，市场上可用的呼吸道黏膜疫苗数量仍然有限，这凸显了开发替代类型疫苗的重要性，例如重组亚单位疫苗和病毒载体疫苗。考虑到某些疫苗（例如针对COVID-19的疫苗）提供的保护可能相对短暂，这一需求尤为迫切。延长疫苗诱导的保护持续时间在很大程度上取决于改善黏膜组织内组织驻留记忆细胞的存活。这一策略不仅增强了个体免疫防御，也支持了大规模免疫工作。因此，呼吸道黏膜作为一个极具前景的疫苗递送途径，迫切需要先进的制剂策略以促进其开发和大规模应用。这一方向为未来的疫苗创新提供了关键途径，并有望有效应对全球公共卫生挑战和改善人类健康结果。