在存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肾活检样本中进行DNA甲基化分析：一项关于糖尿病肾病中白蛋白尿表观遗传标志物的初步研究

《Epigenetics Reports》：DNA methylation profiling in archived FFPE renal biopsies: a pilot study of epigenetic markers of albuminuria in diabetic kidney disease

糖尿病肾病（DKD）的早期诊断依赖肾特异性分子生物标志物。本研究通过靶向分析FFPE肾活检组织中MTOR、COL1A2等7个DKD相关基因的DNA甲基化水平，发现甲基化程度与尿蛋白/肌酐比（UACR）呈显著负相关（r=-0.79，p=0.01），其中MTOR、COL1A2和LCAT的甲基化水平与DKD严重程度高度相关。该研究验证了从存档FFPE组织中进行甲基化分析的可行性，为DKD的生物标志物开发提供了新方法。

　　糖尿病是导致肾功能衰竭的主要风险因素之一，而目前常用的生物标志物如尿白蛋白肌酐比（UACR）在早期检测糖尿病肾病（DKD）方面存在局限性。这些生物标志物缺乏对肾脏组织的特异性与敏感性，往往只能在肾功能显著下降后才能检测到损伤。UACR受到非肾脏因素如运动、水分摄入和感染的影响，而估算肾小球滤过率（eGFR）则依赖于血清肌酐水平，可能在超过50%的肾功能丧失前仍保持在正常范围内。这些局限性凸显了开发针对肾脏的分子生物标志物的迫切需求，以实现对早期、亚临床阶段糖尿病肾病的识别，并在不可逆损害发生前进行风险分层。

DNA甲基化作为一种动态且组织特异性的表观遗传标记，为研究肾脏特异性机制提供了新的视角。然而，大多数关于DKD的甲基化研究主要依赖于血液样本，而未能准确反映肾脏内部的分子变化。为了克服这一限制，本研究尝试利用已存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肾活检样本进行DNA甲基化分析，以揭示DKD相关的表观遗传特征。通过优化的甲基化富集流程和甲基-CpG结合域定量PCR（MBD-qPCR）技术，研究人员成功地对九名患有2型糖尿病且尿白蛋白水平不同的个体的FFPE肾活检样本进行了甲基化分析。研究聚焦于七个与DKD相关的差异甲基化基因网络（DDN）中的基因，包括MTOR、RPTOR、IRS2、COL1A2、TXNRD1、LCAT和SMPD3。这些基因的选择基于两个标准：一是之前在基于血液的甲基化研究中发现它们与DKD风险和尿白蛋白进展相关；二是它们在与DKD相关的三个核心通路中发挥重要作用，即胰岛素信号通路、肾纤维化和细胞外基质重塑以及脂质代谢。

尽管FFPE样本中的DNA已经部分降解，但通过优化的实验流程，研究人员成功提取并富集了DNA。DNA甲基化水平的测定使用了MBD-qPCR方法，通过定制引物针对DDN基因组中的特定区域进行分析。研究结果表明，这些基因的甲基化水平与UACR之间存在显著的负相关关系，相关系数达到-0.79，且具有统计学意义（p=0.01）。这一发现支持了DNA甲基化作为DKD生物标志物的潜力，尤其是在识别疾病严重程度方面。具体而言，MTOR、COL1A2和LCAT基因的低甲基化在尿白蛋白水平较高的个体中尤为明显，提示它们可能作为DKD严重程度的潜在标志物。

本研究不仅验证了基于血液的发现，还展示了在肾组织中进行甲基化分析的可行性。通过利用已存档的FFPE肾活检样本，研究人员能够直接研究肾脏的表观遗传变化，而不是依赖血液中的间接指标。此外，FFPE组织的广泛存档为回顾性分析提供了丰富的资源，而MBD-qPCR技术则避免了硫酸盐处理，更适合处理降解的DNA样本。这些优势使得该方法在生物标志物发现和验证方面具有较高的可扩展性和临床转化潜力。

尽管研究结果具有重要意义，但也存在一些局限性。首先，样本量较小，且研究设计为横断面研究，限制了统计效力和结果的普遍性。其次，缺乏与这些个体的血液样本的配对数据，使得无法进行同一个体肾组织与血液的比较。此外，DNA甲基化可能受到年龄、性别、糖化血红蛋白（HbA1c）和血压等混杂因素的影响，这些因素需要在更大规模的队列中进行正式调整。最后，研究方法未能提供单核苷酸分辨率，未来的研究可以采用混合捕获技术来实现对DDN基因集合中更多调控CpG位点的高分辨率分析，从而进一步阐明甲基化变化在疾病发病机制中的作用。

本研究的结果为利用存档的诊断肾活检样本进行表观遗传生物标志物的发现和验证提供了基础。通过结合肾脏来源的甲基化标记与UACR或eGFR等传统指标，有望提高早期风险分层的准确性。此外，如果这些甲基化变化能够在外周组织中检测到，那么非侵入性的筛查工具可能在未来得到开发，从而在不需要肾活检的情况下实现对DKD的早期诊断和监测。这一发现已经在高血压肾硬化和系统性红斑狼疮肾炎等疾病中得到了验证。

从临床转化的角度来看，本研究为利用存档的诊断肾活检样本进行大规模回顾性研究提供了可能性。如果这些表观遗传标记在更大的研究队列中得到验证，它们可能有助于提高糖尿病肾病的早期诊断率，并实现个性化的风险分层，尤其是在长期患有糖尿病或有肾衰竭家族史的高风险人群中。未来的研究可以进一步探索这些甲基化标记在不同组织中的表现，以确定其是否能够在血液等非侵入性样本中检测到，从而推动更广泛的应用。

总的来说，本研究提供了一个概念验证，证明了在存档的FFPE肾活检样本中进行DNA甲基化分析的可行性，并展示了其在糖尿病肾病研究中的生物学意义。观察到的甲基化水平与尿白蛋白严重程度之间的显著相关性支持了基于甲基化的生物标志物在DKD中的应用潜力，并为在更大规模、前瞻性队列中进行进一步验证奠定了基础。这一方法的推广有望在未来的临床实践中发挥重要作用，特别是在提高早期诊断和风险评估的准确性方面。