一种用于检测Pseudo-nitzschia spp中参与软骨藻酸生物合成的dabA基因的数字PCR方法

《Health & Place》：A digital PCR assay for the dabA gene involved in domoic acid biosynthesis by Pseudo-nitzschia spp

有害藻华预测与假诺氏菌dabA基因数字PCR检测方法研究。摘要：本研究开发了一种靶向dabA基因的数字PCR（dPCR）方法，用于检测产西加利亚毒素的假诺氏菌物种。通过基因序列比对和合成基因片段设计特异性探针，证实该方法可准确区分目标物种并量化基因拷贝数（＞1拷贝/μL）。在加州海岸两次有毒藻华事件采样中，仅Monterey Bay样本检出dabA基因。该方法为藻华毒性预测提供了快速基因表达监测工具，填补了现有基于毒素检测技术的滞后性。

　　本研究聚焦于有害藻华（HAB）的预测与监测，特别是针对一种能够产生神经毒素——麻痹性贝类中毒毒素（DA）的硅藻属（*Pseudo-nitzschia*）物种。研究人员通过开发一种新型的数字PCR（dPCR）检测方法，以更高效地识别和量化DA生物合成途径中的关键基因*dabA*。这项工作旨在提高对HAB事件中潜在毒性的评估能力，从而为早期预警和管理提供科学依据。

### 研究背景

全球范围内的许多海洋环境都经历着由产毒藻类引起的有害藻华。这些藻华不仅影响人类和海洋生物的健康，还可能对商业渔业造成严重破坏。在美国西海岸，*Pseudo-nitzschia*属的硅藻每年都会形成大规模的藻华，并伴随产生DA，这种毒素是麻痹性贝类中毒的主要致病因子。DA能够通过海洋食物链进行生物累积，这种机制可能导致大规模的海洋哺乳动物和鸟类死亡，同时也会导致重要渔业资源的关闭。

2015年，一场极端有毒的*Pseudo-nitzschia australis*藻华从阿拉斯加蔓延至美国西海岸，造成区域性的经济损失。因此，建立常规的HAB监测机制成为减少这些有毒事件对人类健康和渔业影响的重要手段。然而，即使拥有多种监测工具，HAB仍然具有高度的复杂性和不确定性。这主要是因为环境和生物因素会影响*Pseudo-nitzschia*藻华中不同物种的毒素产生能力。传统方法通常依赖于共现研究或对有毒藻华中分离的培养物进行毒素检测，以确定毒素的来源。

### 研究目标

本研究的目标是开发一种更精准、高效的检测方法，以识别*Pseudo-nitzschia*属中具有毒素产生能力的物种。研究人员选择*dabA*基因作为研究对象，因为该基因是DA生物合成途径中的关键基因，并且在多个有毒物种中存在。通过设计针对*dabA*的dPCR方法，可以实现对环境样本中该基因的高灵敏度检测和定量分析，从而为HAB事件的预测和管理提供更及时的信息。

### 方法设计与优化

研究人员基于*dabA*基因序列对来自*P. australis*、*P. multiseries*、*P. multistriata*和*P. seriata*的序列，以及来自红藻*Chondria armata*的非目标基因*radA1*/*radA2*和*Digenea simplex*的*kabA*基因，设计了一种特异性dPCR方法。设计参数包括引物的退火温度范围（53°C至63°C）和探针的退火温度范围（63°C至73°C）。这些参数的设定确保了dPCR方法在检测过程中能够有效区分目标基因与非目标基因，同时提高了检测的准确性和灵敏度。

为了进一步验证dPCR方法的特异性，研究人员对多种*Pseudo-nitzschia*物种的培养物进行了筛查，并在实验室环境中对*dabA*基因的存在进行了确认。此外，研究人员还利用了来自2022年圣巴巴拉海峡和2023年蒙特雷湾的环境样本，以评估该方法在实际应用中的效果。这些样本是在有毒藻华事件期间采集的，通过dPCR方法的检测结果能够提供关于藻华中是否存在毒素产生能力的重要信息。

### 研究结果

dPCR方法成功检测并量化了来自四个有毒*Pseudo-nitzschia*物种的*dabA*基因：*P. australis*、*P. multistriata*、*P. multiseries*和*P. seriata*。这些物种在有毒藻华中具有较高的出现频率，因此被认为是主要的毒素产生者。研究人员进一步使用该方法对来自蒙特雷湾和圣佩德罗湾的*Pseudo-nitzschia*培养物进行了筛查，以确定*dabA*基因的存在情况。结果显示，dPCR方法能够有效识别这些培养物中是否含有*dabA*基因，从而为后续的毒素检测提供基础。

此外，研究人员还利用了环境样本中的数据，以评估dPCR方法在实际应用中的效果。在2022年圣巴巴拉海峡和2023年蒙特雷湾的有毒藻华事件期间，环境样本中的*dabA*基因被成功检测到。这一结果表明，dPCR方法不仅适用于实验室环境，而且在野外环境中也具有良好的适用性。通过这种方法，研究人员能够更早地识别潜在的有毒藻华，从而为相关管理措施提供科学依据。

### 研究意义

本研究的意义在于，通过开发一种新型的dPCR方法，研究人员能够更高效地识别和量化环境样本中与DA产生相关的基因。这种方法不仅提高了检测的灵敏度，还减少了对毒素本身的依赖，从而能够在毒素尚未检测到之前，提供关于藻华毒性的早期预警。此外，dPCR方法的快速检测能力使其适用于实时监测，这对于应对突发的有毒藻华事件具有重要意义。

同时，研究人员还发现，虽然*dabA*基因在多个*Pseudo-nitzschia*物种中存在，但并不是所有个体都能产生毒素。这表明，毒素产生能力可能与个体的基因表达有关，而不仅仅是基因的存在。因此，监测*dabA*基因的表达水平可能比单纯检测基因的存在更具科学价值。此外，研究人员还发现，毒素的产生可能受到环境因素的影响，例如营养条件和二氧化碳浓度。因此，了解这些环境因素如何影响*dabA*基因的表达，对于预测和管理HAB事件具有重要意义。

### 研究展望

未来的研究可以进一步探索*dabA*基因的表达模式，以及环境因素如何影响该基因的表达。此外，研究人员还可以结合其他监测技术，如qPCR、微阵列和环境DNA（eDNA）分析，以提高对HAB事件的综合评估能力。这些技术的结合能够提供更全面的信息，从而为HAB的预测和管理提供更科学的依据。

同时，研究人员还可以扩展dPCR方法的应用范围，以检测其他与毒素产生相关的基因。例如，硅转运基因*sit1*可能与DA的产生有关，因此可以结合*dabA*和*sit1*基因的检测，以更全面地评估HAB事件的毒性。此外，研究人员还可以探索不同地区的*dabA*基因多样性，以评估该方法在全球范围内的适用性。

### 结论

本研究通过开发一种新型的dPCR方法，成功实现了对环境样本中*dabA*基因的高灵敏度检测和定量分析。这种方法不仅提高了对HAB事件中潜在毒性的评估能力，还为早期预警和管理提供了科学依据。通过这种方法，研究人员能够在毒素尚未检测到之前，识别潜在的有毒藻华，从而为相关管理措施提供及时的信息。此外，dPCR方法的快速检测能力使其适用于实时监测，这对于应对突发的有毒藻华事件具有重要意义。未来的研究可以进一步探索*dabA*基因的表达模式，以及环境因素如何影响该基因的表达，以提高对HAB事件的综合评估能力。