来自黑海西部的潜在产毒微藻菌株的形态学、分子生物学及毒素学特征分析

《Health & Place》：Morphological, molecular and toxinological characterization of potentially toxigenic microalgal strains from the western Black Sea

在2021年PHYCOB航线上，黑海分离了32株潜在产毒浮游生物，包括硅藻和甲藻。通过形态学、分子系统学及毒素分析，确认了6株 Protoceratium reticulatum携带西加毒素（YTX），细胞含量1.9-5.4 pg/cell，并发现1株Alexandrium pseudogonyaulax产生goniodomin（14.0 pg/cell）和goniodomin-seco酸（0.33 pg/cell）。此外，4株Alexandrium ostenfeldii鉴定出4种新型spiroxin类似物。研究揭示了黑海主要产毒物种为P. reticulatum和A. pseudogonyaulax，同时证实Karlodinium sp.和Polykrikos hartmannii无溶血活性。

　　在黑海地区，有害藻华（HAB）的现象近年来日益频繁，其主要负面影响来源于一些有毒微藻所产生的强效毒素。然而，关于这些毒素来源的研究数据仍然有限。在2021年9月进行的PHYCOB科考航次中，科学家们对黑海西部地区的潜在有毒浮游植物进行了系统的研究，获取了多种有毒藻类的菌株，并对其形态、系统发育、毒素谱以及细胞毒素含量进行了详细分析。这项研究揭示了黑海地区潜在的毒素来源、多样性及动态变化，为理解该区域的毒素分布和生态影响提供了重要信息。

黑海是一个受强烈淡水输入影响的孤立海洋盆地，其低盐度和永久性垂直分层结构使得该区域的生态系统对浮游植物的繁殖和生长尤为敏感。在黑海生态系统中，浮游植物的爆发已被认为是影响其健康的关键因素之一。此外，通过博斯普鲁斯海峡（伊斯坦布尔海峡）引入的新有毒微藻物种，也有可能适应并形成大规模的藻华，成为潜在的风险来源。尽管过去几十年中，黑海的微藻生物多样性已通过传统光学显微镜法进行过广泛研究，但仍然存在一些关键的知识空白，特别是在潜在有毒浮游植物的鉴定和特性研究方面。因此，开展此类研究对于全面理解黑海的生态健康具有重要意义。

在此次PHYCOB科考航次中，研究人员采集了来自黑海西部（包括罗马尼亚和保加利亚水域）的样本，并通过显微镜和分子方法对这些样本进行了分析。他们从航次中获得了32种菌株，包括一种硅藻和十种潜在有毒的甲藻。在这些菌株中，有20种属于能够产生Yessotoxin（YTX）的甲藻。所有六种Protoceratium reticulatum菌株都含有YTX，其细胞毒素含量在1.9至5.4皮克每细胞（pg cell^-1）之间。此外，在十二种Lingulaulax polyedra菌株中的九种中检测到了微量的YTX变体，而在其他两种甲藻菌株（Gonyaulax sp.和Sourniaea diacantha）中未检测到YTX。所有Alexandrium菌株（包括四株A. tamutum，以及A. andersonii, A. ostenfeldii和A. pseudogonyaulax）均被检测，其中A. pseudogonyaulax菌株在细胞水平上产生了Goniodomine A（GDA）和GDA-seco酸，含量分别为14.0和0.33 pg cell^-1。此外，A. ostenfeldii菌株中检测到了四种之前未被报告的Spirolide类毒素（SPX），其细胞毒素含量在1.0至1.6 pg cell^-1之间。所有可能产生鱼类毒素的菌株（Karlodinium sp.和Polykrikos hartmannii）均未表现出细胞外的溶菌活性。这些发现有助于我们更深入地了解黑海地区毒素的潜在来源、多样性及动态变化。

在黑海地区，已有研究检测到多种毒素，包括麻痹性贝类毒素（PST）、腹泻性贝类毒素（DSP）、pectenotoxins、YTX和domoic acid。这些毒素不仅在野生和养殖贻贝中被发现，也在保加利亚和俄罗斯海岸的浮游植物样本中存在。在保加利亚黑海部分，长期数据表明有28种潜在有毒的浮游植物物种。这些物种中，许多在保加利亚水域的浮游植物群落中很常见，如Alexandrium spp.、Gonyaulax spp.、Lingulaulax polyedra、Prorocentrum spp.和Pseudo-nitzschia spp.。其中，Prorocentrum spp.和Pseudo-nitzschia spp.被认为是典型的“藻华形成”物种。此外，最近应用分子方法的研究还表明，黑海地区可能存在一些被忽视的潜在有毒浮游植物物种，如Pseudo-nitzschia calliantha、Karenia bicuneiformis、Karlodinium veneficum和Pfiesteria piscicida。

然而，对于黑海西部地区微藻毒素来源的详细研究仍然较少，人们对该地区毒素产生微生物的特性了解有限。因此，为了扩大对黑海HAB威胁的认识，开发了PHYCOB项目。本研究的特定目标是通过2021年的PHYCOB航次，从黑海西部地区分离出潜在有毒的浮游植物，并在形态、系统发育、毒素谱和毒素细胞含量等方面对其菌株进行表征。从同一项目和航次中，还对2021年调查中的潜在有毒微藻的分布和丰度进行了详细分析，并结合了不同尺寸样品中的毒素水平测定。这些结果已发表在一篇相关的论文中（Dzhembekova et al., submitted）。这种综合方法有助于更全面地了解哪些浮游植物物种对黑海样本中的毒素产生贡献。

在材料与方法部分，研究人员通过网拖采样和立体显微镜，在采样点预装有过滤海水（FSW）的96孔板中，利用微吸管将单个细胞隔离到单独的孔中。这些隔离板在温度控制的培养箱中（Model MIR 252, Sanyo Electric Biomedical Co.）以20°C和16:8小时光暗周期（光子通量密度约为50 μmol m^?2 s^?1）进行培养，并定期检查生长情况。生长的菌株被转移到70 mL塑料培养瓶中，使用相同的培养条件进行培养。在此次航次中，共获得了32种潜在有毒的浮游植物菌株（见表1）。

在形态学特征分析方面，研究人员利用光学显微镜（LM）观察了采集菌株的活细胞或固定细胞，使用荧光染料Solophenyl Flavine 7GFE500对细胞壁进行了染色，并在显微镜下观察了细胞的形态和大小。细胞长度和宽度的测量通过Axiovision软件进行，并以平均值和范围（最小值、平均值、最大值）的形式报告。对于某些菌株，研究人员还使用了特定的荧光滤光片（如滤光片09）进行更详细的观察。

在DNA提取和系统发育分析方面，研究人员在标准培养条件下培养了菌株，并通过离心法（Eppendorf 5810R, 3220?×?g, 10 min）收集了约50 mL的健康培养物。收集的菌体被转移到微量管中，并再次离心（Eppendorf 5415, 16,000?×?g, 5 min），然后用0.5 mL的SL1裂解缓冲液（由DNA提取试剂盒提供）重新悬浮，并在-20°C保存直至DNA提取。DNA提取使用了NucleoSpin Soil DNA提取试剂盒（Macherey and Nagel, Düren, Germany），并根据制造商的说明进行了调整。DNA提取过程中，使用了细胞破碎器（FastPrep FP120, Thermo-Savant, Illkirch, France）对微量管进行45秒和30秒的振荡处理，以加速DNA释放。DNA的洗脱过程使用了2×50 μL的洗脱缓冲液，以最大化DNA产量。DNA在-20°C保存，直至进一步处理。

为了确定ITS和LSU rDNA序列，研究人员使用了不同的引物组合。对于甲藻，使用了ITSA和ITSB（Sato et al., 2011）以及D1R和D2C（Scholin et al., 1994）作为正向和反向引物；对于硅藻（Pseudo-nitzschia），使用了ITS1和ITS4（White et al., 1990）以及D1R（Scholin et al., 1994）和D3B（Nunn et al., 1996）作为引物。PCR扩增在20 μL反应体积中进行，使用了AccuPower? HotStart PCR PreMix（Bioneer Corporation, Republic of Korea）。反应混合物包含0.5 μL的每种引物（0.25 μM）和约15 ng的DNA。PCR扩增程序包括初始变性步骤（94°C，5分钟），随后进行30个循环，每个循环包括30秒的变性（94°C）、1分钟的退火（55°C）和1分钟的延伸（72°C），最后进行5分钟的延伸（72°C）。PCR产物在Macrogen Europe进行了纯化和双向测序。测序数据使用MEGA版本X（Kumar et al., 2018）进行了手动编辑，并已上传至GenBank数据库（Clark et al., 2016）（见表S1）。

通过使用NCBI BLAST在线工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），研究人员对获得的序列进行了分析，以识别与已知序列相似度最高的菌株。此外，研究人员还编制了不同的数据集，包括来自黑海菌株的序列和GenBank数据库中的序列（见表S2–S5）。序列比对使用了ClustalW（Thompson et al., 1994）在MEGA版本X中进行，除Alexandrium的系统发育分析外，其余均使用默认设置。对于Alexandrium的系统发育分析，研究人员使用了MAFFT版本7（Katoh et al., 2019）在线程序，以进行更精确的比对。

系统发育关系通过MEGA X（Kumar et al., 2018）中的最大似然法（ML）和MrBayes v.3.2（Ronquist and Huelsenbeck, 2003）中的贝叶斯推断法（BI）进行分析。在BI分析中，运行了四条马尔可夫链蒙特卡洛（MCMC）链，持续1,000,000代，每100代进行一次采样。前25%的树被丢弃。系统发育树使用ML结果进行绘制，其中ML方法的bootstrap值（1000次重复）和BI方法的后验概率均被标注。所有位点均被用于分析。有关使用的序列、最终数据集的位点数和应用的模型详细信息，请参见补充材料（表S2–S5）。

对于Sourniaea diacantha菌株和Kareniaceae家族的其他菌株，研究人员使用MEGA X（Kumar et al., 2018）中的配对距离法（Pairwise Distance）进行了进化分歧的估算（见表S6–S9）。

在毒素筛查方面，研究人员将菌株在标准培养条件下培养为批量培养。在生长的后期或早期稳定期，细胞被收集，并通过计算细胞密度和计数超过400个细胞来测定毒素细胞含量。50 mL的菌株子样通过离心（3220?×?g，10分钟）收集，细胞沉淀物被重新悬浮在剩余培养基中，并转移到微量管中再次离心（16,000?×?g，5分钟），然后在-20°C冷冻保存，直至进一步处理。为了提高毒素检测方法的灵敏度，某些菌株的生长和收集过程被重复几次，以获得更高的生物量。

细胞沉淀物被转移到含有0.9克裂解矩阵D（Thermo Savant, Illkirch, France）的2 mL微量离心管中。随后，沉淀物被悬浮在500 μL的0.3 M醋酸中，用于麻痹性贝类毒素（PST）的分析，或悬浮在500 μL的甲醇中，用于脂溶性毒素的分析，并通过FP120 FastPrep仪器进行反向摇晃处理（最大速度6.5 m s^-1，45秒）。处理后，样品再次离心（16,000?×?g，15分钟，4°C），上清液被转移到旋滤器（孔径0.45 μm，Millipore Ultrafree，Eschborn，Germany）中，并再次离心30秒（3220?×?g）。过滤后的样品被转移到HPLC小瓶（Agilent Technologies，Waldbronn，Germany）中，并在-20°C保存，直至分析（Weber et al., 2021）。

对于domoic acid（DA）的分析，研究人员从培养瓶中取50 mL的子样，并通过GF/C滤膜（直径25 mm，孔径1.2 μm，Sigma-Aldrich，Taufkirchen，Germany）进行过滤。细胞被转移到含有0.9克裂解矩阵D的2 mL微量离心管中，并加入1 mL的50%甲醇和0.03 M醋酸的混合液，进行反向摇晃处理（最大速度6.5 m s^-1，45秒）后，样品再次离心（16,000?×?g，5分钟，4°C），上清液被转移到旋滤器（孔径0.45 μm Nylon膜，Millipore，Eschborn，Germany）中，并再次离心30秒（3220?×?g）。过滤后的样品被转移到HPLC小瓶中，并在-20°C保存，直至分析（Weber et al., 2021）。

在PST分析方面，研究人员使用了修改后的液相色谱（LC）结合柱后衍生荧光检测（PCOX）方法。详细信息请参见补充材料中的分析方法部分。对于脂溶性毒素的分析，研究人员使用了超高效液相色谱（UPLC?）结合串联四极杆质谱（LC-MS/MS）分析，以检测多种脂溶性毒素（包括DA）。UPLC系统包括柱温箱、自动进样器和二元泵（AQUITY I UPLC Class，Waters，Eschborn，Germany）。详细信息请参见补充材料中的分析方法部分。

在YTX分析方面，除了多种脂溶性毒素的分析，研究人员还通过SRM模式（负离子模式）在LC-MS/MS系统中扫描了YTX的变体。该系统包括LC色谱仪（LC1100，Agilent）和API 4000-QTrap串联质谱仪（Sciex，Darmstadt，Germany）。对于环胺类毒素（如gymnodimines和spirolides）的分析，研究人员使用了Martens et al.（2017）描述的方法，其中SPX通过与外部校准曲线（13-desmethyl-spirolide C，SPX-1；认证参考物质（CRM）；NRC，Halifax，NS，Canada）进行校准，并以SPX-1等效单位表示。校准曲线使用了不同浓度的SPX-1：10 pg μL^-1、50 pg μL^-1、100 pg μL^-1和1000 pg μL^-1。同样，gymnodimines（GYM）通过与外部校准曲线（GYM A，CRM；NRC）进行校准，并以GYM A等效单位表示。12-甲基-gymnodimine A由Biomol GmbH（Hamburg，Germany）提供，用于化合物鉴定。对于GYM的定量分析，使用了不同浓度的标准溶液：10 pg μL^-1、50 pg μL^-1、500 pg μL^-1和1000 pg μL^-1。在环胺类毒素筛查中，包含了所有已知的GYM和SPX的过渡（precursor ion > fragment ion），并列于表S11中。四种新型SPX的准确质量通过超高效液相色谱（UHPLC）结合高分辨率质谱仪（Q-Exactive Plus，Thermo Fisher Scientific，Schwerte，Germany）进行测定。详细信息请参见补充材料中的分析方法部分。

在Karlotoxin（KmTx）分析方面，研究人员使用了SRM方法，以典型KmTx碎片在正离子模式下进行检测，以确定KmTx相关化合物的可能存在。1367?→?937的质量过渡用于KmTx的筛查，以确定KmTx的存在。实验基于Krock et al.（2017）之前描述的方法进行。

在细胞外溶菌活性分析方面，研究人员评估了Karlodinium sp.和Polykrikos hartmannii菌株的细胞外溶菌活性，使用了Cryptomonas（KAC 30，来自Kalmar培养物）作为目标物种，该物种在标准条件下进行培养。简要而言，完整C. salina细胞在24小时处理后被计数，与对照组（仅用培养基处理）进行比较。30 mL的Karlodinium sp.和Polykrikos hartmannii培养物在早期稳定期被离心（3220?×?g，10分钟）。上清液被分装到三个玻璃瓶中（每个4 mL）。每个瓶中加入0.1 mL的Cryptomonas salina（调整至1?×?10? cells mL?1）。样品和对照组（仅使用培养基）在黑暗中以20°C进行24小时培养。培养后，0.5 mL的子样用2% Lugol's碘液固定，并在显微镜下计数完整C. salina细胞（至少600个细胞）。T-test统计量用于比较处理组和对照组的Cryptomonas细胞计数。

在结果部分，研究人员获得了三十种菌株，包括一种硅藻和十种潜在有毒的甲藻物种。其中，Pseudo-nitzschia calliantha的两种菌株在站19被采集。在光学显微镜下，两种菌株的细胞形态相同，且呈轻微的S形（见图2）。细胞长度约为70 μm（两种菌株：62.0（68.7）78.0 μm；n=30），细胞宽度为3 μm（2.5（3.0）3.6 μm；n=30）。然而，这两种菌株在SEM和/或TEM的超结构确认之前就失去了。不过，序列数据表明这两种菌株（LSU rDNA序列100%相同，ITS rDNA序列99.5%相同，由于某些碱基不明确）被鉴定为Pseudo-nitzschia calliantha Lundholm, Moestrup & Hasle。黑海菌株的LSU rDNA序列与多个不同地点的P. calliantha序列（包括澳大利亚、斯洛文尼亚和西班牙）完全相同。ITS序列的最高BLAST相似度为99.87%，与日本海的P. calliantha菌株（GenBank登录号：KT247436和KT247434）一致。

在黑海的ITS序列分析中，P. calliantha菌株被分为三个支持度高的组，其中一组进一步分为两个支持度高的子组（见图4）。黑海BS 5-E11菌株被放置在最大的组中，该组包含了来自不同地点的菌株。

对于Alexandrium ostenfeldii菌株BS 5-D3，ITS和LSU序列均未在GenBank数据库中找到100%相同的序列。ITS序列的最高BLAST相似度为98.72%，与秘鲁的A. ostenfeldii菌株（GenBank登录号：JX841265）一致。相比之下，LSU序列仅与美国和挪威的菌株（GenBank登录号：LC433663和JF521637）相差2个碱基对。在系统发育树中，黑海A. ostenfeldii菌株（BS 5-D3）与来自不同地理区域的A. ostenfeldii菌株（ML 98%，BI 1.00）聚类在一起，位于Kremp et al.（2014）定义的组6中。黑海菌株与来自美国的菌株聚类在一起，但与来自挪威的菌株（类型产地）和瑞典的菌株（Kattegat海岸）的聚类情况不同，这与Kremp et al.（2019）的发现相悖。

对于Alexandrium pseudogonyaulax菌株BS 6-D1，ITS rDNA序列与西班牙的两个菌株（GenBank登录号：AM237416和AM237417）完全相同。LSU序列的最高BLAST相似度为99.4%，与马来西亚、中国、挪威和日本的菌株一致。基于ITS rDNA序列，BS 6-D1菌株被放置在支持度高的A. pseudogonyaulax簇中，包含来自不同地理区域的菌株（见图4）。

在黑海，Alexandrium tamutum的四种菌株（BS 4-A1、BS 5-C12、BS 3-D6和BS 5-C7）被分离出来。这些菌株的大小和形态相似（细胞长度：23.0（27.3）34.3 μm，细胞宽度：21.6（25.2）31.6 μm；n=40）。细胞形态为圆形至椭圆形，平均长度/宽度比为1.08 ± 0.03（n=40）。物种鉴定基于细胞左侧1′板的腹腔孔的存在、6′′板的宽度以及后腹腔板的形态（见图3）。所有四种A. tamutum菌株的ITS rDNA序列相同，而LSU序列略有变化。黑海菌株与亚得里亚海的菌株相似，形成了一个独立的支持度高的簇（见图4）。

在黑海，Gonyaulax sp.的菌株BS 5-E4的ITS rDNA序列与GenBank数据库中的参考序列相似度较低。最高BLAST相似度为87.67%，与加拿大的菌株（GenBank登录号：MT041622）一致。LSU序列的最高BLAST相似度为96.06%，与韩国的菌株（Jinhae Bay，GenBank登录号：EF613349）一致。在基于LSU rDNA序列的系统发育树中，S. diacantha菌株形成了一个单系簇（ML 79%，BI 0.99），并被分为两个支持度高的子簇（ML 99%，BI 1.00）（见图6）。黑海菌株BS 6-D7形成了一个独立的分支，与称为ribotype B的簇（Zhang et al., 2020）强支持地聚类在一起，该簇包括来自中国（渤海）、韩国和加拿大的菌株（Esquimalt Lagoon）。黑海菌株BS 6-D7与其它S. diacantha菌株之间的遗传距离较高，特别是在部分ITS比对中（七个序列，529 bp），范围从12.6%到25.5%（见表S6），而在部分LSU序列中（12个序列，702 bp），范围从4%到12%（见表S7）。

在黑海，Protoceratium reticulatum的六种菌株（BS 4-B11、BS 6-E4、BS 4-F3、BS 6-H12、BS 3-D6和BS 4-F11）被采集。所有菌株的形态相同（见图5）。细胞呈次球形，长度大于宽度，但形态和大小存在变化。所有菌株的细胞长度为20.7（25.5）32.2 μm（n=40），细胞宽度为17.2（21.8）25.4 μm（n=40）。细胞的cingulum位于中线以上，并且深度刻蚀，位移约一个cingulum宽度。细胞具有高度装饰的theca，包括隆起的脊和众多孔，每个多边形装饰上有一个孔。在荧光显微镜下，主要的板排列为APC、3′、1a、6′′、6′′′和2′′′（见图5）。在第一顶板上可见一个大的腹腔孔。在epitheca上，有一个背侧位于孔板上的间板。

在黑海的ITS rDNA序列分析中，P. reticulatum菌株均显示相同的ITS rDNA序列，除了BS 4-B11菌株，该菌株在比对长度中显示了一个过渡（一个位置）。在系统发育树中，黑海的P. reticulatum菌株聚类在一个簇中（ML 75%，BI 1.00），该簇被定义为“ribotype B”（见图7）。该簇包括来自温带地区的菌株。类型产地的菌株（挪威，Bergen）位于簇A中。瑞典菌株（Kattegat海岸）与簇A聚类在一起，支持度高（ML 90%，BI 1.00），这与Wang et al.（2019）的发现不同，后者将其放置在簇外。所有黑海P. reticulatum菌株的LSU rDNA序列相同，与多个GenBank参考序列（来自不同地理区域，包括代表所有三个ribotype的菌株）显示100%的相似性。

在毒素谱和细胞毒素含量分析中，Pseudo-nitzschia calliantha的两种菌株（BS 3-F11和BS 4-H4）被检测为domoic acid（DA）的生产者，但未检测到高于LOD的水平（DA的LOD值分别为6.0和8.3 fg cell^-1）。所有Alexandrium spp.菌株（包括四株A. tamutum、一株A. andersonii、一株A. ostenfeldii和一株A. pseudogonyaulax）均被检测为生产PSTs、goniodomins和cycloimines（gymnodimines和spirolides）。但这些菌株中未检测到PSTs（见表S12）和gymnodimines。所分析的毒素的仪器检测限和使用的进样体积见表S13。只有A. pseudogonyaulax菌株含有GDA和GDA-seco酸，其细胞毒素含量分别为14.0和0.33 pg cell^-1。碰撞诱导解离（CID）实验表明，黑海A. ostenfeldii菌株BS 5-D3中检测到了四种尚未报告的SPX类似物（见图10）。这些SPX的细胞毒素含量以SPX-1等效单位表示，范围为1.0至1.6 pg cell^-1。CID的LOD值（S/N=3）见表S14。四种新型SPX的m/z值和保留时间分别为：Cp 1: 694, 10.61分钟；Cp 2: 697, 8.89分钟；Cp 3: 724, 10.81分钟；Cp 4: 753, 10.23分钟。Cp 1-4的高分辨率质量数据及其主要碎片见表S15-A至-D。

在黑海，Karlodinium sp.的两种菌株（BS 6-E10和BS 3-F8B）被检测为KmTx相关化合物的生产者，但均未检测到当前已知的KmTx。KmTx的LOD值分别为1.0和2.2 fg cell^-1。所有20种潜在YTX生产菌株（Gonyaulax sp.、Sourniaea diacantha、Protoceratium reticulatum和Lingulaulax polyedra）均被检测为YTX生产者。然而，Gonyaulax sp.（BS 5-E4）和S. diacantha（BS 6-D7）的菌株中未检测到YTX。在Protoceratium reticulatum的六种菌株中，所有菌株均含有YTX，其细胞毒素含量在1.9至5.4 pg cell^-1之间（见表S16）。在Lingulaulax polyedra的十二种菌株中，有九种检测到了YTX变体（见表S17），但未检测到YTX。最丰富的YTX同系物是45-羟基-1a-同源YTX（质量过渡m/z 1171?→?1091），其次是9-甲基-41a-同源YTX（质量过渡m/z 1169?→?1089）、trinor-YTX（质量过渡m/z 1101?→?1021）以及化合物21和22（质量过渡m/z 1061?→?981），这些化合物由Miles et al.（2005a, 2005b）报告。此外，还检测到了五种其他潜在的YTX，包括m/z 1173 →1093（Carboxy-YTX）、m/z 1131?→?1051（未描述）、m/z 991?→?911（化合物17，Miles et al. 2005a; b）、m/z 1195?→?1115（未描述）和m/z 1887?→?1807（未描述）。YTX的检测限见表S18。

在黑海，Karlodinium sp.和Polykrikos hartmannii的菌株均被测试了对Cryptomonas salina的潜在溶菌活性。供体菌株的细胞密度分别为135×10³和92×10³ cells mL^-1（Karlodinium菌株BS 6-E10和BS 5-F8B）以及0.43×10³ cells mL^-1（P. hartmannii菌株BS 7-E9）。所有三种菌株在24小时培养期间均未显示出任何溶菌活性，即处理组和对照组的Cryptomonas细胞密度没有显著差异（T-test: p>0.3）。

在讨论部分，研究人员指出，通过黑海地区新分离的菌株，首次对这些物种进行了详细的系统发育和毒素学表征，同时提供了形态学描述。这些数据有助于更好地理解黑海地区水样和海洋生物中的毒素来源和动态变化。

在Pseudo-nitzschia方面，黑海地区的P. calliantha是唯一被确认能产生domoic acid（DA）的硅藻，其单株在Sevastopol湾的DA水平为0.1至1 pg cell^-1（Besiktepe et al., 2008）。尽管已有八种其他Pseudo-nitzschia菌株被描述为潜在DA生产者，但其本地种群的毒素生产尚未被证实。本研究中获得的两种新P. calliantha菌株均未检测到DA的生产，这与航次中未在浮游植物样本中发现DA的结果一致（Dzhembekova et al., submitted）。由于某些Pseudo-nitzschia菌株可能携带与DA生物合成相关的dab基因簇，但DA的生产可能受到环境因素的调节，因此需要进一步研究以确认在其他培养条件下是否能够检测到DA的生产。

在Alexandrium spp.方面，黑海地区有多种Alexandrium菌株被记录在浮游植物清单中，但其多样性仍不明确，因为大多数菌株缺乏形态学证据。例如，Gómez and Boicenco（2004）的清单中包含两种Alexandrium菌株，其中A. ostenfeldii被认为是有效记录，而A. monilatum则被列为可疑/可疑物种。另一份清单（Krakhmalny et al., 2018）包括了七种Alexandrium菌株（A. affine, A. catenella, A. minutum, A. monilatum, A. ostenfeldii, A. pseudogonyaulax, A. tamarense）。最近的元条形码研究基于短的SSU序列，讨论了A. andersonii、A. margalefii和A. tamutum等Alexandrium菌株的存在。此外，A. margalefii和A. tamarense在保加利亚水域被鉴定为基于ITS和LSU数据的单细胞PCR结果（GenBank登录号：PV242896, PV242897, PV252065和PV252064，未发表数据）。然而，目前在黑海地区对这些菌株的形态学证据仍然有限。通过此次研究提供的菌株数据，我们为黑海地区Alexandrium的多样性讨论提供了实质性贡献。

Alexandrium andersonii的形态学证据被首次提供，并由长的rDNA序列支持