整合的转录组学和代谢组学分析揭示了分泌钙的植物Ceratostigma willmottianum对CaCl2和Ca(NO3)2的不同响应

《Industrial Crops and Products》：Integrated transcriptomic and metabolomic analyses reveal differential responses of the calcium-secreting plant Ceratostigma willmottianum to CaCl 2 and Ca(NO 3) 2

本研究以钙分泌植物C. willmottianum为模型，通过转录组学和代谢组学分析，发现CaCl?因Cl?毒性导致光合抑制和生长受阻，而Ca(NO?)?通过NO??的氮代谢支持缓解胁迫。盐腺通过增加Ca2?转运蛋白和分泌相关基因表达，提升Ca2?外排能力，其机制涉及抗氧化和代谢网络重构。

　　钙盐在土壤中广泛存在，过高的浓度会降低作物产量。在钙盐胁迫下，植物同时受到阴、阳离子的影响，使得准确评估是哪种离子造成损害以及植物如何应对变得困难。本研究通过转录组学和代谢组学方法，对能够分泌钙的植物**Ceratostigma willmottianum**进行了处理，使用等渗100 mM CaCl?和Ca(NO?)?，探讨其对不同钙盐和特定离子的分子机制。研究结果表明，CaCl?导致活性氧（ROS）积累、叶绿体破坏和生长抑制。相应地，CaCl?主要上调与糖代谢和黄酮类化合物生物合成相关的基因，导致可溶性糖和黄酮类化合物的积累。相比之下，Ca(NO?)?并未造成胁迫损伤，这可能与NO??作为氮源的缓解效应有关。NO??上调了氮同化和叶绿素合成相关基因，从而导致脯氨酸、谷胱甘肽和叶绿素的积累。此外，钙盐处理增加了叶片中的Ca2?含量，并增强了盐腺中的Ca2?区隔化和分泌能力。超微结构分析显示，钙盐处理后囊泡数量相应增加。同时，与Ca2?转运蛋白、Ca2?结合蛋白和囊泡运输成分相关的基因上调，表明它们在促进离子分泌中的重要作用。总体而言，本研究为钙分泌植物在高钙环境中的适应策略提供了新的见解，并阐明了其对Cl?、NO??和Ca2?的分子响应机制。

### 钙盐胁迫的生理影响与植物适应机制

土壤盐碱化已成为全球粮食生产的主要制约因素之一。据最新统计，盐碱地占全球土地面积的7%，而可耕地中约有20%受到盐碱化影响，导致每年粮食产量减少约2700万吨（Chele等，2021；Srarfi和Majar，2024）。盐胁迫对植物生长和生理的影响已被广泛研究（Zhao等，2020；Pan等，2021），为理解植物在盐碱环境中的响应提供了重要依据。在土壤溶液中，盐类会解离为自由的阳离子和阴离子，而盐胁迫主要归因于这些离子在植物组织中的过度积累。土壤盐碱主要包括Na?、Ca2?、Cl?和SO?2?（Stavi等，2021）。然而，植物在盐碱条件下的敏感性并非对所有离子都相同。不同离子对植物生理和代谢的影响各不相同（Tavakkoli等，2010；Wu等，2023；Liu等，2025b）。尽管已有研究揭示了植物对不同离子的差异反应，但这些反应背后的分子机制仍不清楚。因此，要全面理解盐胁迫机制，并为培育耐盐作物提供针对性策略，必须深入研究植物对特定离子的响应机制。

钙盐不仅在自然盐碱化中起重要作用，还在人为引起的土壤盐碱化中扮演关键角色。在一些地区，如中国西南部，钙盐胁迫已成为农业发展的主要障碍（Wei等，2018；Feng等，2022）。虽然钙是植物生长发育必需的大量元素，但细胞质中的Ca2?浓度严格调控并维持在纳摩尔水平（通常为100–200 nM）（Demidchik等，2018）。过量的Ca2?会破坏钙信号传导，并损害基于磷酸盐的能量代谢（Karabourniotis等，2020；Liu等，2025a）。通常情况下，当组织中的Ca2?含量超过干重的5%时，会诱导活性氧（ROS）的积累、光合作用的抑制以及代谢紊乱（White和Broadley，2003；Liu等，2025b）。钙氯化物（CaCl?）是一种常见且高溶解性的盐，在多种盐碱环境中普遍存在（Colla等，2013；Cirillo等，2019）。对于一些物种，如黄瓜和**Callistemon citrinus**，CaCl?表现出更强的植物毒性，并对光合作用产生更严重的抑制作用（Colla等，2013；Cirillo等，2019）。除了自然盐碱化，人为活动，如不合理的施肥和灌溉，也常常导致二次土壤盐碱化。在设施农业土壤中，Ca2?和硝酸盐（NO??）是主要的离子，使得硝酸钙[Ca(NO?)?]成为盐碱的主要来源（Zhou等，2023；Yang等，2024）。研究表明，过量的Ca(NO?)?严重抑制光合作用并降低作物产量（Zhou等，2023；Yang等，2024）。

### 钙盐胁迫下阴离子的植物毒性效应

除了Ca2?，阴离子在钙盐胁迫下同样具有植物毒性。在以NaCl为主的盐碱环境中，氯离子（Cl?）对植物的挑战往往与钠离子（Na?）相当，甚至更严重。例如，在豆科作物（Tavakkoli等，2010；Iqbal等，2024）和柑橘植物（Moya等，2003）中，Cl?在相同浓度下对植物的生理损伤比Na?更为严重。植物对Cl?的耐受阈值通常在干重的0.7%到1.5%之间，超过这一范围则会出现毒性症状（Raveh和Levy，2005）。Cl?胁迫的关键特征包括叶片黄化、叶绿素降解、ROS积累、光系统损伤以及光合作用的抑制（Raveh和Levy，2005；Liu等，2025b）。硝酸盐（NO??）是植物生长的重要氮源，参与氨基酸、核苷酸和叶绿素的合成（Wen等，2020）。在吸收后，NO??通过硝酸盐还原酶（NR）和亚硝酸盐还原酶（NIR）的作用被还原为铵离子（NH??）（Wei等，2018；Liu等，2025b）。NH??随后通过谷氨酰胺合成酶（GS）/谷氨酸合成酶（GOGAT）途径转化为谷氨酸，而谷氨酸作为叶绿素生物合成的关键前体（Wen等，2020）。通常情况下，NO??在非生物胁迫条件下会刺激渗透调节物质（如脯氨酸、可溶性蛋白）和抗氧化剂（如谷胱甘肽、抗氧化酶）的积累，从而增强胁迫耐受性并改善光合作用性能（Chen等，2021a；Jia等，2023）。然而，过量的NO??也可能引发营养失衡、色素降解以及光合作用和生长的抑制（Zhang等，2022；Yang等，2024）。尽管植物对特定阴离子和阳离子的响应在表型和生理层面已有充分研究，但相关的代谢和分子机制仍不清楚。多组学方法，能够快速全面地分析分子调控网络和代谢途径，为阐明植物对不同盐离子的响应机制提供了有力的策略。

**Ceratostigma willmottianum**（茜草科）是一种原产于中国的落叶亚灌木，因其蓝色花朵而受到消费者喜爱（Shi等，2022）。该植物的叶片具有盐腺，这是一种被角质层包裹的多细胞表皮结构，在紫外光激发下会表现出明显的自荧光（Caperta等，2020；Liu等，2025a）。在自然条件下，这些盐腺会分泌碳酸钙（CaCO?），这种特性被认为是对高钙环境的生态适应（Liu等，2025a）。因此，我们选择这一物种作为模型系统，以研究盐腺的适应意义及其钙离子分泌机制。尽管我们之前的研究表明**C. willmottianum**能够耐受高钙胁迫（Liu等，2025a），但使用等摩尔和等渗Ca(NO?)?和CaCl?处理的结果显示了显著的差异：前者未引起明显损伤，而后者几乎致命（Liu等，2025b）。这表明阴离子（Cl?和NO??）在这一过程中起着关键作用，尽管其具体机制仍不清楚。本研究采用了整合的生理、代谢组学和转录组学方法，以阐明植物对不同钙盐及其组成离子（Cl?、NO??和Ca2?）的分子机制和代谢网络。研究结果提供了关于植物如何应对特定离子胁迫的关键见解，并进一步加深了我们对盐腺在高钙环境中的适应作用及其钙离子分泌机制的理解。

### 实验材料与方法

本研究使用了一年生的**C. willmottianum**插条。2024年4月，从四川农业大学现代农业研发基地的资源苗圃中随机选取健康、大小均匀的插条（30°33′24″N，103°38′42″E）。在将根部用自来水冲洗以去除土壤后，插条被移植到含有珍珠岩的塑料盆中（18 × 13 × 16 cm）。植物每天两次用半强度Hoagland营养液进行灌溉。生长条件维持在300 μmol m?2 s?1的光照强度、12/12小时（昼/夜）光周期、25/18°C（日/夜）温度和60%相对湿度。在一个月的适应期后，叶面用1%硝酸（HNO?）处理以去除积累的分泌物，随后用去离子水彻底冲洗以去除残留酸。

基于我们之前的研究，显示在100 mM CaCl?和Ca(NO?)?处理下，该植物表现出最高的Ca2?分泌率和最显著的表型差异（Liu等，2025b），因此我们选择了100 mM作为本研究的处理浓度。实验包括三个处理：（1）半强度Hoagland营养液（对照，ψ? = ?0.06 MPa），（2）添加100 mM Ca(NO?)?的营养液（ψ? = ?0.74 MPa），（3）添加100 mM CaCl?的营养液（ψ? = ?0.77 MPa）。所有溶液的pH值调整为5.7。考虑到两种盐溶液的渗透势（ψ?）几乎相同，可以独立评估Cl?和NO??的特定影响。为了防止渗透冲击，盐浓度以每12小时50 mM的增量逐渐增加至目标水平。在适应期结束后，植物每天两次用各自的处理溶液进行灌溉。每个处理包括三个重复，每个重复有六株植物。

在处理后第1、5、10和15天，记录植物高度、冠幅、生物量和气体交换参数。盐腺分泌能力也在这些时间点进行评估。在处理第5天采样的叶片用于后续的生理、转录组学和代谢组学分析。本研究中使用的样本是完全展开的成熟叶片，具体为枝条上的第3至第8片叶子。

### 气体交换和叶绿素荧光检测

使用数码相机拍摄枝条顶端第五片叶子的照片。植物高度和冠幅用卷尺测量。随后，植物被收获，根部用自来水冲洗以去除附着的珍珠岩。表面水分用纸巾吸干后，用电子天平测量鲜重。

从上午9点至中午12点，使用CIRAS-3便携式光合作用系统（PP SYSTEMS，美国）监测净光合速率（P?）、气孔导度（G?）和细胞间CO?浓度（C?）。每组处理至少测量10片叶子。程序设置如下：光合有效辐射（PAR）为1000 μmol m?2 s?1，叶室温度为25°C，参考CO?浓度设定为环境浓度，流速为250 mL min?1，相对湿度为60%。使用相同的叶子，通过FMS-2脉冲调制荧光计（PP SYSTEMS，美国）在暗适应和光适应状态下测量叶绿素荧光。根据Cirillo等（2019）的方法计算光系统II（PSII）的最大光合效率（F?/F?）、PSII的有效量子产率（ΦPSII）、光化学淬灭系数（qP）和非光化学淬灭（NPQ）。每组处理至少测量12片叶子。

### 叶绿素、叶绿素合成中间体、NH??和硝酸盐还原酶的检测

新鲜叶片被切碎并均匀混合。0.1 g叶片转移至含有10 mL 95%乙醇的试管中，在黑暗中提取24小时。随后，根据Liu等（2025b）的方法测定叶绿素a（Chl a）、叶绿素b（Chl b）和类胡萝卜素（Caro）的含量。另外，0.3 g叶片用80%碱性乙醇（80%体积百分比乙醇 + 20%体积百分比1%氨水）进行匀浆，并在黑暗中提取24小时。叶绿素合成中间体，包括原卟啉IX（Proto IX）、镁原卟啉IX（Mg-Proto IX）和原叶绿素（Pchlide），根据Liu等（2025b）的方法进行定量。进行三次生物学重复。

NH??含量的测定按照Chen等（2021b）的方法进行。具体而言，0.3 g新鲜叶片匀浆至8 mL 10%乙酸中。离心3500 rpm 15分钟，取2 mL上清液至10 mL试管中。随后加入3 mL 0.2%水合靛酚和0.1 mL 1%抗坏血酸。在沸水浴中反应15分钟，使用紫外可见分光光度计（Specord 200 plus，Analytik Jena，德国）在580 nm处测量混合物的吸光度。进行三次生物学重复。

硝酸盐还原酶（NR）活性的测定按照Chen等（2021b）的方法进行。使用打孔器制备10 mm直径的叶盘。0.3 g叶盘转移至10 mL试管中。然后加入4 mL 100 mM磷酸缓冲液（pH 7.2）和3 mL 200 mM KNO?溶液。在30°C黑暗中反应30分钟，离心（4000 rpm，10分钟）。取2 mL上清液至10 mL试管中，加入2 mL 1%磺胺和2 mL 0.2%α-萘胺。反应25分钟后，使用紫外可见分光光度计在540 nm处读取混合物的吸光度。进行三次生物学重复。

### 盐腺分泌能力的评估

盐腺分泌能力的评估采用叶盘法。成熟叶片被收集，使用打孔器制备10 mm直径的叶盘。将叶盘浮于人工木质部汁液（0.5 mM KH?PO?，1 mM KNO?，0.1 mM CaCl?，pH 5.5）中，叶盘的表面被矿物油覆盖（Liu等，2025a）。将这些叶盘置于受控环境条件下培养：25°C，200 μmol m?2 s?1光照强度，以及12/12小时（光/暗）光周期。24小时后，使用微量采样器从叶盘表面收集分泌液，并测量每片叶盘的分泌液体积。每组处理至少分析10片叶盘。

### 盐腺中Ca2?含量的检测

使用荧光Ca2?指示剂Fluo-8/AM（Liu等，2025a）检测盐腺中的Ca2?含量。成熟叶片被收集并切成3 mm2的方块。这些片段在室温黑暗中孵育6–8小时，其中包含0.02% Pluronic F-127的10 μM Fluo-8/AM负载溶液。孵育后，样本用磷酸缓冲液冲洗。使用激光扫描共聚焦显微镜（Leica STELLARIS STED，德国）进行荧光成像。操作条件为：激发波长490 nm，发射波长530 nm，功率10%，正常扫描速度，帧大小512 × 512。为了消除自荧光，还额外拍摄了405 nm激发和450 nm发射的图像。使用Fiji软件对单个盐腺的荧光强度进行量化以确定相对Ca2?水平。盐腺直径使用软件的标尺工具进行测量。每组处理至少分析20个盐腺。

### 叶绿体和盐腺的超微结构观察

成熟叶片被切成2 mm × 2 mm的片段，并立即在2.5%戊二醛中进行初级固定12小时，随后在1%锇酸中进行二级固定。样本随后通过梯度乙醇系列（30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%）脱水，每个浓度脱水20分钟。之后，样本被嵌入EPON 812环氧树脂中。使用超薄切片机（Leica UC7rt，德国）制备70 nm的超薄切片，贴附于铜网，并在室温下用铀酸铵（10–15分钟）和醋酸铅（1–2分钟）染色。最后，使用透射电子显微镜（JEM-1400FLASH，JEOL，日本）观察叶绿体和盐腺的超微结构（Yuan等，2016）。

### 通过NMT测量盐腺中的Ca2?外排速率

使用非侵入式微测试技术（NMT；NMT100-SIM-XY，Younger USA，美国）测量单个盐腺的Ca2?外排速率（Lu等，2020）。简而言之，玻璃微电极（4–5 μm孔径）用约10 mM的填充溶液（100 mM CaCl?）反向填充。电极尖端用40–50 μm的Ca2?选择性液态离子交换器（LIX；XY-SJ-Ca）前向填充。将银/银氯电极插入微电极的背面。微电极在标准溶液（0.05、0.1和0.5 mM CaCl?）中进行校准。将下表皮小心剥离并固定在含有5 mL检测溶液（0.1 mM KCl、0.1 mM CaCl?、0.1 mM MgCl?、0.5 mM NaCl、0.3 mM MES、0.2 mM Na?SO?，pH 6.0）的培养皿中，叶盘的背面朝上。经过10分钟平衡后，将微电极定位在盐腺上方约30 μm处，并沿Z轴移动。Ca2?外排速率（pmol cm?2 s?1）在5秒间隔内记录5分钟。每组处理至少测量6个盐腺。

### 代谢组学分析

使用超高效液相色谱（UHPLC）系统（Vanquish，Thermo Fisher Scientific，德国）耦合到Q Exactive? HF轨道阱质谱仪（Thermo Fisher Scientific，德国）进行代谢物谱分析。样本处理和分析遵循Zhu等（2024）的方法。使用正交投影到潜在结构-判别分析（OPLS-DA）模型确定变量重要性在投影（VIP）得分（Zhu等，2024）。差异代谢物（DEMs）通过VIP ≥ 1、|log?（fold change）| ≥ 1和调整后的p值 ≤ 0.05的阈值进行识别。每组处理包括5个生物学重复。DEMs通过京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行通路富集分析（www.kegg.jp）。此外，使用MetWare Cloud平台（https://cloud.metware.cn）进行主成分分析（PCA）、层次聚类和k-means聚类。

### 转录组学分析

通过上海Biozeron生物科技有限公司（中国上海）使用Illumina HiSeq 2500平台进行总RNA提取、文库构建和测序。清洁读数被对齐到**C. willmottianum**基因组（未发表数据）。基因表达水平以每千碱基对每百万映射读数的碎片数（FPKM）进行量化。差异表达基因（DEGs）通过|log?（fold change）| ≥ 1和调整后的p值 ≤ 0.05的阈值进行识别（Liu等，2024）。每组处理包括3个生物学重复。使用MetWare Cloud平台进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）以识别与表型相关的模块。关键模块中的基因被选择进行基因本体（GO）和KEGG富集分析。共表达网络使用Cytoscape（v3.8.0）进行可视化。

### 实时定量PCR分析（qRT-PCR）

为了进一步验证RNA-seq数据的可靠性，使用qRT-PCR对关键基因的表达变化进行了检测。尽管所选基因的FPKM值与qRT-PCR获得的相对表达水平不同，但整体表达趋势一致（图S5）。qRT-PCR结果表明，与CaCl?处理相比，糖代谢相关基因，如**CwAMY**（Cwi05G021950）和**CwBGL**（Cwi03G004100）的表达显著上调（图S5A、B）。与黄酮类生物合成相关的基因，如**CwFLS**（Cwi06G016380）和**CwANS**（Cwi03G008260），在CaCl?处理下上调，但在Ca(NO?)?处理下下调（图S5C、D）。相反，与氮同化和叶绿素代谢相关的基因，如**CwNRT**（Cwi01G007430）、**CwP5CS**（Cwi01G040260）和**CwGluTR**（Cwi05G012660），在Ca(NO?)?处理下上调（图S5E–G）。其中，**P5CS**编码δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶。此外，与钙结合和离子运输相关的基因，如**CwCML44**（Cwi01G010830和Cwi01G010810）、**CwACA2**（Cwi02G005790）、**CwCAX2**（Cwi02G006910）和**CwVAMP724**（Cwi02G012430）在两种钙盐处理下均显著上调（表1）。其中，**CML**和**VAMP**分别编码钙调素样蛋白和囊泡相关膜蛋白。

### 统计分析

数据以均值±标准误（SE）表示。通过单因素方差分析（ANOVA）和Bonferroni事后检验确定不同处理之间的显著性差异（p < 0.05）。所有统计分析使用IBM SPSS Statistics 20（IBM Corp., 美国）进行。图表使用Origin 2021（OriginLab, 美国）生成，图示使用Adobe Illustrator 2023（Adobe Inc., 美国）进行编辑。差异基因（DEGs）和差异代谢物（DEMs）的热图在MetWare Cloud平台进行可视化。

### 结果

在100 mM CaCl?和Ca(NO?)?处理下，5天后观察到叶片黄化和绿色变化（图1A）。在15天后，CaCl?处理显著（p < 0.05）降低了植物高度、冠幅和生物量（图1B–D）。值得注意的是，盐腺的气体交换和分泌能力在处理5天后已显示出差异。CaCl?降低了P?和G?，并增加了C?（图1E–G）。然而，Ca(NO?)?未影响P?，但导致G?和C?的降低。此外，分泌液体的体积以及Ca2?分泌率在处理5天后达到最高（图1H–G）。基于这些时间响应模式，我们选择了处理5天后的样本进行后续的生理和组学分析。

在Ca(NO?)?处理下，F?/F?、ΦPSII、qP和NPQ均未发生变化；然而，在CaCl?处理下，这些参数显著下降（p < 0.05）（图2A–D）。Chl a和Chl b含量在Ca(NO?)?处理下增加，但在CaCl?处理下减少（图2E、F）。Caro含量在两种钙盐处理下均未变化（图2G）。与Ca(NO?)?处理相比，CaCl?处理下Mg-Proto IX和Pchlide含量显著增加（图2H–J）。然而，Proto IX含量在两种处理下均略有下降（p > 0.05）。NH??含量和NR活性在Ca(NO?)?处理下增加，但在CaCl?处理下保持不变（图2K、L）。此外，两种钙盐处理均显著增加了叶片中的Ca2?含量（p < 0.05）（图2L）。

与表皮细胞相比，盐腺能够富集Ca2?。在钙盐处理下，盐腺的Ca2?含量和直径均显著增加（p < 0.05）（图4A–C）。此外，单个盐腺在100 mM CaCl?和Ca(NO?)?处理下的Ca2?外排速率明显高于对照（图4D、E）。盐腺由多种细胞类型组成，包括巨型中央分泌细胞、辅助细胞和内杯细胞、外杯细胞。这些细胞被厚厚的角质层包裹（图4F）。这些腺体具有密集的细胞质、大量线粒体，且缺乏叶绿体，这与其他茜草科植物的特征相符（Yuan等，2016；Caperta等，2020）。在对照条件下，盐腺含有大量连续的囊泡（图4G）。然而，钙盐处理，尤其是Ca(NO?)?，增加了囊泡和线粒体的数量。此外，囊泡内的电子致密物质也随着钙盐处理而增加。

在CaCl?处理下，盐腺的囊泡数量显著增加，而Ca(NO?)?处理则未显著改变囊泡数量。然而，Ca(NO?)?处理显著增加了囊泡和线粒体的数量，同时囊泡内的电子致密物质也增加。此外，Ca(NO?)?处理还显著增加了与α-亚麻酸代谢相关的代谢物，如创伤酸、9,10-DHOME和十七烷三烯（图4E）。在CaCl?处理下，这些代谢物的含量显著减少。

在CaCl?和Ca(NO?)?处理下，共鉴定出1231种差异代谢物（DEMs）。在CaCl?与对照（C100 vs. CK）的比较中，鉴定出651种DEMs；在Ca(NO?)?与对照（N100 vs. CK）的比较中，鉴定出663种DEMs；在Ca(NO?)?与CaCl?（N100 vs. C100）的比较中，鉴定出876种DEMs。此外，148种代谢物在所有三个比较组中均显著改变（图S1E）。

为了可视化CaCl?和Ca(NO?)?处理下DEMs的变化趋势，使用k-means聚类分析将1231种DEMs分为三个簇（图5A）。簇1主要富集于黄酮类和异黄酮类；簇2富集于四吡咯和衍生物、氨基酸、肽和类似物以及脂类（图5B）。此外，簇1和簇2均富集于碳水化合物和碳水化合物共轭物。KEGG富集分析显示，簇1中的DEMs富集于淀粉和蔗糖代谢以及色氨酸代谢（图5C）。相比之下，簇2中的DEMs富集于氨基酸生物合成和卟啉代谢相关的通路（图5D）。总体而言，CaCl?似乎激活了与碳水化合物和黄酮类生物合成相关的代谢物积累，而Ca(NO?)?促进了氨基酸、叶绿素和脂类的合成。

在Ca(NO?)?处理下，与氨基酸和核苷酸合成相关的代谢物显著增加（图6C，表S2）。两种钙盐处理均促进了谷胱甘肽（GSH）的积累，其中Ca(NO?)?处理更为显著。此外，在叶绿素代谢通路（图6D）中，大多数DEMs，如原卟啉原（porphobilinogen）、原叶绿素a（pheophorbide a）和脱镁原叶绿素a（pyropheophorbide a）均因Ca(NO?)?处理而增加。与α-亚麻酸代谢相关的DEMs，如创伤酸、9,10-DHOME和十七烷三烯，因Ca(NO?)?处理而增加，但在CaCl?处理下减少（图6E）。

在CaCl?处理下，鉴定出2308种差异表达基因（DEGs）。具体而言，C100 vs. CK比较中鉴定出1098种DEGs，N100 vs. CK比较中鉴定出1113种DEGs，N100 vs. C100比较中鉴定出1460种DEGs。此外，104种DEGs在所有三个比较组中均显著改变。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）对DEGs与代谢物和生理指标的相关性进行分析。共表达网络包括2308种DEGs。在去除低表达变异的基因后，剩余的1127种基因被分配到九个共表达模块（图7A、B；图S3）。

模块Yellow和Cyan与可溶性糖和黄酮类物质的积累显著正相关（图7C）。KEGG富集分析表明，这些模块中的基因主要参与淀粉和蔗糖代谢、单萜生物合成以及黄酮类生物合成（图7D）。同样，GO富集分析显示，这些模块中的基因主要与次级代谢过程、次级代谢物生物合成过程以及苯丙烷生物合成过程相关（图S4A）。模块Greenyellow与NH??、SP和Chl a含量显著正相关（图7C）。KEGG富集分析表明，这些模块中的基因主要参与氮代谢、苯丙烷生物合成以及糖胺聚糖降解（图7D）。同样，GO富集分析显示，这些基因主要参与硝酸盐跨膜转运活性、硝酸盐转运和亚硝酸盐转运（图S4B）。模块Pink与Ca2?含量和Ca2?分泌速率显著正相关，表明这些模块中的基因可能参与对Ca2?胁迫的响应（图7H）。我们鉴定出16种编码钙结合蛋白、自动抑制Ca2?-ATP酶（ACA）、阳离子/Ca2?交换器（CAX）和Ca2?通道的基因（表1）。除了Ca2?通道基因外，这些基因的表达均因钙盐处理而上调。此外，鉴定出三种与囊泡运输相关的基因，并且它们的表达也因钙盐处理而上调（表1）。此外，在模块Pink中鉴定出四种转录因子（TFs），其中bHLH家族表现出高连接性（图7H）。

### 讨论

#### 4.1. CaCl?诱导胁迫损伤并激活系统防御反应

等摩尔浓度的CaCl?和Ca(NO?)?具有相同的渗透势（Liu等，2025b）。因此，在排除渗透干扰的情况下，可以评估两种钙盐及其特定离子对植物生理的影响。在本研究中，100 mM CaCl?处理诱导了**C. willmottianum**的显著胁迫症状，包括叶片黄化和光合作用抑制（图1）。在Ca(NO?)?处理的植物中未观察到这些症状，表明差异效应主要归因于不同的阴离子（Cl? vs. NO??）。Cl?毒性已被广泛研究，过量积累会导致叶片黄化和坏死（Raveh和Levy，2005；Geilfus，2018；Iqbal等，2024）。与这一机制一致，我们的离子定量结果显示，CaCl?处理的植物中阴离子积累量约为Ca(NO?)?处理的两倍（图3J、K）。这种氯离子负担可能解释了观察到的胁迫症状，因为当Cl?含量超过干重的0.7%时，大多数酶促反应都会受到损害（Raveh和Levy，2005；Liu等，2025b）。

在盐胁迫下，植物最明显的反应是光合作用的降低。光合作用的抑制可能是由于气孔限制，即由气孔关闭引发的CO?缺乏，或者是非气孔限制，包括光系统损伤和酶活性的降低（Wu等，2023；Liu等，2025b）。在本研究中，CaCl?处理下P?和G?降低，而C?升高。这表明非气孔因素对光合作用的影响，而不仅仅是气孔限制。超微结构证据进一步表明，CaCl?处理导致叶绿体结构的破坏。作为光合作用的主要细胞器，叶绿体的解体直接损害其光能捕获和碳同化能力（Pan等，2021；Liu等，2024）。叶绿素荧光参数的变化进一步支持这一结论。F?/F?和qP的下降反映了PSII量子产率和电子传递效率的降低，而NPQ的升高则表明光能捕获的热耗散增加，这以牺牲光化学淬灭（即碳固定）为代价（Cirillo等，2019；Wu等，2023）。

当光系统之间的电子传递链受到限制时，叶绿体成为ROS产生的主要场所（Pan等，2021；Zahra等，2022）。这些ROS氧化细胞成分，导致膜脂质过氧化和随后的电解质泄漏。在本研究中，CaCl?处理下ROS水平显著升高，表明诱导了严重的氧化应激。为了应对这种应激，抗氧化酶活性显著增强，显示出主动清除过量ROS并恢复细胞稳态的反应（Zhao等，2020；Wu等，2023）。除了抗氧化酶，非酶促代谢物，如可溶性糖和黄酮类物质，在维持ROS稳态中也起着关键作用。在盐胁迫下，可溶性糖具有双重功能：一方面作为渗透调节物质维持细胞水平衡，另一方面作为抗氧化剂，其还原性羟基直接参与ROS的清除（Zhao等，2020；Wu等，2023）。转录组学分析显示，在CaCl?胁迫下，与可溶性糖生物合成相关的基因，如β-果糖苷酶（INV）、SPP和ENG，显著上调（图8A）。这种转录激活与随后的可溶性糖积累相一致。这一发现与关于苜蓿的研究结果一致，即耐盐品种在盐碱条件下积累显著更多的可溶性糖（Liu等，2024；Ni等，2024）。除了参与可溶性糖生物合成的基因，CaCl?胁迫还上调了参与多糖分解的基因，包括BGL、AMY和内切葡聚糖酶（EG）（图8A）。最终，这些基因的协同表达促进了可溶性糖的积累。

黄酮